Name: Imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de Drosophila melanogaster femelle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct des cellules souches germinales chez Drosophila melanogaster. Cette méthode permet d'observer la division asymétrique et la dynamique du spectrosome dans la niche ovarienne.

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Nous remercions Acaimo González Reyes et María Olmedo López pour leurs commentaires utiles sur le manuscrit. Cette étude a été soutenue par PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), « Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor » de Junta de Andalucía (J. G-M), « Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos » des VI et VII PPIT-Université de Séville (P. R-R) et « Contrato de Acceso de I+D+i » de VI PPIT-Université de Séville (P. R-R). Nous exprimons nos remerciements à la Company of Biologists Ltd pour avoir aimablement fourni les droits de partage d’images adaptées de la publication originale (doi :10.1242/DEV.199716).

REMARQUE : L’étape 1.4 doit être effectuée au moins 2 jours à l’avance. Les étapes 2.1 et 2.2 peuvent être effectuées 1 jour à l’avance.
1. Configuration pré-expérimentale I
<ol>
	<li>Préparez 100 μL d’aliquotes d’un mélange d’antibiotiques streptomycine/pénicilline (10 000 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine) et conservez-les à -20 °C jusqu’à l’utilisation.</li>
	<li>Préparez 15 ml des solutions suivantes à l’aide d’eau pure autoclave, conservez-les à 4 °C et utilisez-les dans un délai d’un mois : bicarbonate de sodium (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 et 0,1 % Tween 20.</li>
	<li>Préparez le milieu de culture et la solution suivants dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination. Utilisez des embouts et des tubes filtrants stérilisés.
	<ol>
		<li>Préparer 2 mL d’aliquotes de sérum fœtal bovin non dilué et conserver à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé dans des conditions aseptiques.</li>
		<li>Préparez le milieu de drosophile de Schneider complété par un mélange d'antibiotiques 15 % FBS et 0,6 % d'antibiotiques streptomycine/pénicilline. Préparez 7 mL d’aliquotes et conservez-les à 4 °C. Une aliquote suffit pour deux plaques MatTek (voir section 2).
		<ol>
			<li>Préparez la solution de Ringer (128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 4 mM de MgCl2, 35,5 mM de saccharose, 5 mM de Hepes dans de l'eau pure autoclavée ; pH de 6,9). Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prélever des mouches âgées de 1 à 2 jours exprimant de manière constitutive et ubiquitaire la protéine Par-1 fusionnée à la GFP (poly Ubiquitin-mGFP6 ::p ar-1 line) dans un nouveau tube avec de la nourriture pour mouches complétée par de la poudre de levure. Cultivez-les pendant 2 jours à 25 °C dans un incubateur avant la dissection. 
	REMARQUE : Cette étape peut être effectuée avec n’importe quel rapporteur d’intérêt marqué par fluorescence.</li>
</ol>
2. Revêtement et préparation de la plaque de fond en verre
<ol>
	<li>Placez une goutte de 3 μL d’un adhésif Cell-Tak spécifique (ci-après appelé adhésif pour cellules et tissus) au centre de la lamelle d’une plaque revêtue de poly-D-lysine de 35 mm (plat à fond en verre, voir tableau des matériaux) sans étalement manuel. Utilisez des embouts stériles. 
	REMARQUE : L’adhésif pour cellules et tissus doit être stocké à 4 °C. Dans le cas d’expériences avec deux conditions génétiques (généralement, des conditions de contrôle et des conditions mutantes), placez deux gouttes individuelles et bien séparées de l’adhésif dans la même plaque de fond en verre. Cela garantira que les deux fonds génétiques sont imagés dans les mêmes conditions.</li>
	<li>Immédiatement après, ajoutez soigneusement un volume égal (3 μL dans cette configuration de protocole) de 0,1 M NaHCO3 pH 8,0 dans la goutte d’adhésif de 3 μL recommandée par le fabricant et mélangez par pipetage.</li>
	<li>Pour une évaporation complète, incubez la plaque à température ambiante (RT) pendant 20 min puis conservez-la à 4 °C pendant une nuit pour l’utiliser le lendemain. Vous pouvez également incuber la plaque préparée à 37 °C pendant 25 minutes jusqu’à l’évaporation complète et passer directement à l’étape suivante. Dans les deux cas, entretenez la plaque avec son couvercle. Utilisez des embouts stériles.</li>
	<li>Laissez le plat à fond en verre préparé atteindre RT en le plaçant sur le banc pendant 15 à 20 minutes avant utilisation.</li>
	<li>Lavez soigneusement 3 fois l’assiette préparée. Évitez de toucher et de perturber la ou les couches adhésives. À chaque lavage, ajoutez 6 μL d’eau pure autoclavée puis retirez l’eau à l’aide d’un embout propre pour chacun des trois lavages afin d’éliminer les résidus de la solution NaHCO3.</li>
	<li>Permettez l’évaporation complète de l’eau en plaçant la plaque propre et préparée à RT tout en disséquant pendant 5 à 10 minutes avec son couvercle pour éviter les particules de poussière.</li>
</ol>
3. Dissection ovarienne de la drosophile et isolement et montage de l’ovariole
REMARQUE : La dissection de l'ovaire est réalisée dans la solution de Ringer (au lieu du milieu de Schneider) sans FBS pour éviter la présence de protéines qui pourraient interférer avec l'adhérence du tissu de l'échantillon à l'adhésif.
<ol>
	<li>Nettoyez une boîte de dissection à trois puits, une pince et des aiguilles de dissection avec de l’éthanol à 70 % avant de commencer.</li>
	<li>Ajouter un volume suffisant (~200 μL) de solution de Ringer dans chacun des trois puits.</li>
	<li>Disséquez les ovaires de 5 femelles nourries à la levure dans 200 μL de solution de Ringer dans le premier puits à l'aide de deux paires de pinces en suivant les procédures standard 10,11. Saisissez la femelle drosophile à l’intersection du thorax et de l’abdomen avec l’une des pinces. Ensuite, déchirez doucement la cuticule au niveau de la partie postérieure de l’abdomen et tirez sur la cuticule de l’abdomen jusqu’à ce que les deux ovaires soient exposés.</li>
	<li>Transférez les ovaires disséqués dans le deuxième puits pour réduire la contamination par des restes d’autres tissus ou des débris résultant de la dissection.</li>
	<li>Retirez la gaine musculaire de 15 à 20 ovarioles à l’aide d’un stéréomicroscope (zoom 8X-13,5X) avec éclairage à diodes électroluminescentes (LED) et pinces à pointe fine. Utilisez une paire de pinces pour ancrer tout le corps de l’ovaire, et utilisez la seconde pour saisir en douceur une chambre d’ovule à un stade avancé et étirer doucement jusqu’à ce que le muscle se brise et soit à la traîne. 
	REMARQUE : Il est essentiel d’éviter d’endommager la germaria simplement en réduisant le contact avec cette partie des ovaires. Retirez les chambres d’œufs plus anciennes que les stades 8-9.</li>
	<li>Transférez un par un les 15 à 20 ovarioles sans gaine musculaire à l'aide de la pince dans le troisième puits contenant 200 μL de milieu de Ringer.</li>
	<li>Pré-mouiller une pointe de 20-200 μL avec 0,1 % de Tween 20 par pipetage. Cela évite l'adhérence des ovarioles aux parois en plastique de la pointe.</li>
	<li>Transférez 6 μL de solution de Ringer contenant les ovarioles sans gaine musculaire à l'aide d'une pointe pré-humidifiée sur la plaque adhésive préparée (conservée à RT). 
	REMARQUE : Évitez tout contact entre la pointe et la couche adhésive pour éviter le détachement de germaria après le dépôt de l’ovariole (étape suivante). Environ 30 % des germaria n’adhèrent pas comme prévu.</li>
	<li>Pour vous assurer que les ovarioles transférés adhèrent à la surface adhésive, enfoncez-les soigneusement jusqu'au fond de la goutte de Ringer jusqu'à ce qu'ils entrent en contact avec la surface adhésive à l'aide d'une aiguille de dissection ou d'une pince 
	REMARQUE : N’essayez pas de réorganiser les ovarioles une fois qu’ils se sont installés.</li>
	<li>Remplissez soigneusement la plaque MatTek avec 3 ml de milieu Schneider's complété par le mélange d'antibiotiques 15 % FBS et 0,6 % de streptomycine/pénicilline (étape 1.3). Pour éviter le détachement des ovaires, ajouter lentement 1 mL à la fois sur le pourtour extérieur de la plaque.</li>
	<li>Transportez la plaque contenant les ovarioles sans gaine musculaire sur une surface plane jusqu’à la station de microscope.</li>
</ol>
4. Imagerie en direct à l’aide d’un microscope confocal
<ol>
	<li>Placez la plaque sur l’objectif 63x d’un microscope à disque rotatif ou d’un microscope confocal (un équipement similaire peut être utilisé) et focalisez l’échantillon. Sélectionnez le plan z du milieu pour chaque germarium.</li>
	<li>Configurez les paramètres expérimentaux suivants : type de capture : time-lapse 3D, réglage de la puissance laser de 70/100, longueur d’onde d’excitation : 488 nm, portée de l’empilement z : 30 μm et distance entre les piles Z : 1,2 μm, durée : 17 h, intervalle entre les points temporels : toutes les 10 min.</li>
	<li>Si disponible, à l’aide d’une option multi-positions, redéfinissez les coordonnées XY des échantillons et sélectionnez un plan Z au milieu de chaque germarium, car les piles Z seront centrées dans cette position. Lancez l’acquisition. 
	REMARQUE : Comme la largeur normale d’un germarium est de 30 μm, chaque pile Z sera de ~25-27 sections. Selon le confocal, au moins 25 germaria peuvent être imagés dans les 10 minutes d’intervalle. Normalement, des objectifs à immersion dans l’huile 40x/1,30 ou 63x/1,40 NA, corrigés par planapo, sont utilisés.</li>
	<li>Analysez les images dans le temps et sur l’axe Z pour visualiser des changements spécifiques dans la morphologie du spectrosome à l’aide du logiciel Imaris ou ImageJ (Fiji) 12,13. Des moments spécifiques de leur observation sont affichés (Figure 1B'). Pour monter les vidéos, sélectionnez manuellement le meilleur plan Z à chaque point temporel.</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
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<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous présentons ici un protocole pour surveiller la niche GSC de Drosophila melanogaster pendant une période prolongée, jusqu’à 16 h. La plupart des protocoles pour filmer les processus biologiques de la drosophile ex vivo se concentrent sur des fenêtres de temps plus courtes et de multiples exemples peuvent être trouvés pour les disques alaires imaginaux 15,16,17, les gonades embryonnaires 18,19 ou les ovaires 20,21,22,23. Certes, la durée de l’acquisition de l’image dépend du processus de développement examiné. Alors que des événements transitoires peuvent se produire dans une plage qui peut varier de quelques millisecondes à quelques secondes selon le type de cellule et les conditions physiologiques24, d’autres processus, tels que la division cellulaire, peuvent nécessiter des heures ou des jours de tournage pour être observables. En particulier, le cycle cellulaire des CSG femelles de la drosophile prend environ 12 à 14 heures pour être complété25. Dans Villa-Fombuena et al. (2021)8, l’estimation de la durée du cycle complet était de 15,5 h, telle que déterminée par l’étude des changements dans la morphologie des spectrosomes. La combinaison de cette méthode d’imagerie avec des marqueurs de chromatine et/ou la technologie Fly-FUCCI26 a montré qu’une GSC se divisait généralement toutes les 15,5 h et que les durées moyennes des phases du cycle cellulaire étaient les suivantes : M (forme ronde, 22 min), G1 (forme ronde G1, forme Plug et Bar, 3,45 h), S (forme de fusion, 43 min) et G2 (forme de fusion, Point d’exclamation, et Formes rondes, 10,5 h). Les données brutes concernant la durée des phases du cycle cellulaire sont présentées dans Villa-Fombuena et al.8. Ces observations étaient cohérentes avec les études précédentes qui utilisaient l’imagerie fixe pour analyser le cycle cellulaire de la GSC et la morphologie du fusome 25,27,28. De plus, cette méthode in vivo pourrait aider à déchiffrer les conséquences en aval d’une division anormale de la GSC et/ou de la dynamique du spectrosome dans la sélection des ovocytes en aval puisque le fusome joue un rôle majeur dans ces événements. De plus, ce protocole peut être appliqué pour analyser le taux de division GSC chez les mutants établis ou nouveaux.
L'acquisition continue d'images pendant de longues heures implique une série de questions critiques à prendre en compte, principalement le maintien de l'intégrité des tissus et de leur fonctionnalité et la préservation de la fluorescence de l'échantillon. Le maintien des bonnes conditions environnementales des cellules de niche est essentiel pour éviter les dysfonctionnements, les stress, l’arrêt du cycle cellulaire ou la mort cellulaire. Dans les conditions de cette étude, les GSCs peuvent entrer en mitose, une étape critique pour indiquer la santé des tissus, même après 12 heures ou plus pendant le tournage. Ainsi, nous supposons que les germaria cultivés conservent leur intégrité et leur fonctionnalité pendant la majeure partie du temps d’imagerie. De même, en raison de la nouvelle production de matériel GFP :Par-1 (voir Villa-Fombuena et al. 2021)8 tout au long du cycle cellulaire, et puisque nous réduisons l’acquisition d’images à seulement une fois toutes les 10 minutes, même les points temporels les plus proches de la fin des films conservent suffisamment de signal pour permettre leur analyse. Dans tous les cas, le blanchiment des échantillons peut être potentiellement corrigé par des plugins tels que la correction de l’eau de Javel13.
Pour imiter un environnement approprié ex vivo, les tissus des insectes peuvent être maintenus à l’aide du milieu de Schneider pendant un certain nombre d’heures pendant le tournage avec une supplémentation spécifique. Il est important de noter que ce protocole n’utilise pas de facteurs de croissance ou d’extrait de mouche autres que FBS. Une étude antérieure a montré que de nombreuses GSC sont normalement arrêtées en G2 et entrent dans la phase M par des niveaux élevés d’insuline25. Ainsi, nous n’ajoutons pas d’insuline aux conditions de culture pour éviter cette stimulation anormale du cycle cellulaire de la GSC. L’ajout de FBS au milieu de dissection peut également réduire le risque que les chambres d’œuf se collent à la pointe de la pipette ou à la boîte en verre pendant le transfert d’ovariole21. Enfin, l’utilisation d’antibiotiques est appropriée pour les films prolongés afin d’éviter la prolifération bactérienne et/ou fongique. La prolifération de micro-organismes dans les boîtes de culture peut altérer l’homéostasie du tissu et, par conséquent, affecter la division cellulaire. Dans ce protocole, le milieu contient un mélange d’antibiotiques (généralement supplémenté à 1 % (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). De même, de longues incubations peuvent affecter l’efficacité des antibiotiques, et le remplacement du milieu pourrait être envisagé pour prévenir la décomposition des antibiotiques.
Drosophila germaria sont entourés d’une gaine musculaire tubulaire qu’il est nécessaire d’enlever pour empêcher les mouvements péristaltiques, de rotation et de contraction typiques de ce tissu29,30. Ainsi, l’ablation de cette gaine musculaire améliore l’observation des signaux rapporteurs, permet l’utilisation de configurations de réglage confocal pour minimiser le blanchiment du signal et les photodommages, et permet d’obtenir des images à haute résolution temporelle. En revanche, la contribution de la gaine musculaire à l’homéostasie du tissu est encore inconnue. Ainsi, sa suppression peut affecter d’une manière ou d’une autre le fonctionnement normal du créneau de la GSC. Un autre inconvénient du système est que le germaria peut se détacher de l’adhésif pendant le tournage et dériver dans le milieu environnant. Par conséquent, les images peuvent se déplacer à l’intérieur de points temporels ou même lors de l’acquisition de la série z donnée. Si c’est le cas, différents plugins peuvent être utilisés pour corriger le mouvement de l’échantillon dans ImageJ, tels que les méthodes de recalage12.
En résumé, nous avons mis au point une méthode pour acquérir des films étendus de germarias en direct. Bien que cette méthode ait permis une définition détaillée du cycle cellulaire de la GSC et de la corrélation entre la dynamique du spectrosome et les différentes phases du cycle cellulaire de la GSC, nous sommes conscients de certaines des limites inhérentes à notre protocole. Tout d’abord, l’acquisition d’images se fait dans un milieu artificiel où les conditions environnementales ne récapitulent pas exactement les conditions in vivo . Cependant, comme nous avons obtenu des résultats similaires concernant la morphologie des spectrosomes au cours des différentes phases du cycle cellulaire que ceux rapportés par d’autres auteurs utilisant des tissus fixes31, nous pensons que ce protocole récapitule largement les conditions in vivo . Deuxièmement, bien que l’intégrité et la fonctionnalité des tissus ne semblent pas affectées par les cultures de 16 h de long, nous n’avons pas évalué cela avec soin. Idéalement, on pourrait transplanter le germaria filmé dans un abdomen féminin et évaluer s’il peut produire de nouvelles chambres d’œufs comme le font les germaria de contrôle32. La méthode d’imagerie en direct utilisée dans cette étude est un outil précieux pour l’analyse de la division asymétrique de la GSC, en particulier pour la biologie ovarienne de la drosophile en général. De plus, cette approche est particulièrement adaptée aux études pharmacologiques de composés chimiques, de facteurs de croissance ou de nutriments, car ils peuvent être directement complétés dans les milieux de culture. De plus, nous pouvons placer des échantillons expérimentaux et de contrôle dans la même plaque, minimisant ainsi les variations techniques au sein des expériences.

L’imagerie en direct des processus biologiques est essentielle pour obtenir des preuves expérimentales directes. La combinaison de la microscopie confocale avancée et de l’optimisation des méthodologies permet d’explorer de multiples événements biologiques avec une grande précision. L’optimisation des étapes dans les protocoles tels que la manipulation et la dissection des tissus, la préparation et la conservation des échantillons, et les paramètres d’acquisition de la microscopie est essentielle pour maximiser la fiabilité et la robustesse des résultats obtenus. Ici, nous présentons un protocole de suivi d’échantillons pour une imagerie étendue, qui est spécialement axé sur les ovaires de Drosophila melanogaster. L’ovaire de Drosophila melanogaster est un excellent système modèle pour l’analyse d’un large éventail de processus de développement. Parmi beaucoup d’autres, cet organe reproducteur de la mouche des fruits Drosophila melanogaster contient une niche de cellules souches adultes très bien définie. Cette niche GSC soutient le développement des gamètes femelles à l’âge adulte. Les ovaires de la drosophile sont composés d’environ 18 ovaires, où se développent les chambres des ovules dans le germarium. À l’extrémité de chaque germarium, 2 à 4 GSC sont maintenues dans une niche cellulaire somatique principalement formée d’un filament terminal de 8 à 10 cellules, d’une rosette de 5 à 8 cellules de coiffe et de 2 à 3 cellules d’escorte antérieures (Figure 1A). Cette niche somatique fournit aux GSCs des signaux essentiels et un soutien physique pour maintenir leur souche, contrôler la prolifération et prévenir la différenciation1,2,3,4,5.
Les GSCs se divisent normalement de manière asymétrique pour générer une nouvelle cellule souche qui reste en contact avec la niche somatique et une cellule fille, le cystoblaste (CB), qui perd le contact direct avec les cellules de la coiffe somatique et se différencie. Les CSG et les CB contiennent un organite cytoplasmique hautement dynamique, le spectrosome, dont la fonction principale est l’orientation correcte du fuseau mitotique pendant la mitose6. Le CB se divise 4 fois avec une cytokinèse incomplète pour développer des kystes à 16 cellules, où l’une des cellules germinales se spécifie dans l’ovocyte et les 15 autres cellules deviennent des cellules nourricières. Le spectrosome CB se développe en une structure ramifiée appelée fusome qui relie les cellules germinales interconnectées à 16 cellules. Le spectrosome est enrichi en petites vésicules et en protéines squelettiques telles que la sérine-thréonine kinase Par-1 et le composant membranaire Hu-li tai shao (Hts)7. Au cours du cycle cellulaire de la GSC, le spectrosome se développe par l’ajout de nouveau matériau et change de forme, ce qui permet d’identifier les phases G1, S, G2 et M (Figure 1B)8,9.
Nous avons récemment mis en œuvre une méthode de culture ex vivo du germarium de drosophile qui permet d’imager des GSC vivantes jusqu’à 16 h. Étant donné que ces cellules se divisent une fois toutes les 15,5 h en moyenne8, cette méthode permet de filmer de grandes parties du cycle cellulaire de la GSC. Ainsi, en combinaison avec d’autres outils, notre méthode de culture a permis de décrire la morphologie des spectrosomes au cours du cycle cellulaire de la GSC et d’analyser la durée des différentes phases du cycle cellulaire in vivo8 (Figure 1C). Nous fournissons ici un protocole détaillé de cette méthode d’imagerie en direct étendue, soutenu par une vidéo guidée étape par étape qui décrit la méthodologie (Figure 2).

<table><tbody><tr><td>Plaque de verre à 9 puits</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot ; 2H2O ; Pour préparer la solution de Ringer</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>354240</td><td>Adhésif pour cellules et tissus utilisé pour fixer des cellules ou des sections de tissus à de nombreux types de surfaces, y compris le plastique, le verre, le métal, le polymère FEP et les matériaux biologiques.</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps&nbsp ;</td><td>Finescience</td><td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps&nbsp ;</td><td>Finescience</td><td>11255-20</td><td>Dimensions 0,05 mm x 0,02 mm et longueur 11 cm</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Qualifié, inactivé par la chaleur, approuvé par l’UE, Amérique du Sud Origine&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plats à fond en verre</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Plat de 35 mm, lamelle n° 1.5, diamètre du verre de 10 mm,&nbsp ; Poly-D-Lysine enrobé</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Pour préparer la solution de Ringer</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td>MgCl2 ; Pour préparer la solution de Ringer</td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>Roboz&nbsp ;</td><td>RS-6061</td><td>Poignée creuse légère en acier inoxydable ; 4 3/4" de long.</td></tr><tr><td>Jumelles Nikon SMZ18</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10 000 U/mL</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl ; Pour préparer la solution de Ringer</td></tr>, <tr><td>la drosophile de Schneider Medium</td><td>Biowest&nbsp ;</td><td>L0207</td><td>Milieu de culture cellulaire pour cellules d’insectes</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875&nbsp ;</td><td>NaHCO3 ; &ge ; 99,5 %, poudre</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl ; Pour préparer la solution de Ringer</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>&ge ; 99,5 % (GC) ; Pour préparer la solution de Ringer</td></tr><tr><td>Aiguille de dissection en tungstène</td><td>Roboz&nbsp ;</td><td>RS-6064</td><td>0,25 mm, ultra fin, pointe de 1 micron (Pk 10)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>pour la biologie moléculaire, liquide visqueux</td></tr><tr><td>Poudre de levure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de drosophila melanogaster femelle

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Les méthodes d’imagerie en direct permettent d’analyser les processus cellulaires dynamiques en détail et en temps réel. L’ovaire de la drosophile représente un excellent modèle pour explorer la dynamique d’une myriade de processus de développement, tels que la division cellulaire, la souche, la différenciation, la migration, l’apoptose, l’autophagie, l’adhésion cellulaire, etc., au fil du temps. Récemment, nous avons mis en œuvre une culture ex vivo étendue et une imagerie en direct de la niche GSC de la drosophile femelle. En utilisant une lignée de drosophile hébergeant un transgène GFP ::P ar-1 à titre d'exemple, cette méthode permet de visualiser la division asymétrique des GSC au sein de leur niche et de décrire les changements de morphologie du spectrosome tout au long du cycle cellulaire. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la culture ex vivo de Drosophila germaria, permettant une visualisation prolongée de la niche femelle de la GSC. Il est important de noter que ce protocole est largement applicable aux GSC d’imagerie en direct avec plusieurs protéines d’intérêt marquées par fluorescence qui sont disponibles dans les centres de stockage et/ou dans la communauté de recherche sur la drosophile.

Avec ce protocole prolongé d'imagerie en direct, nous pouvons enregistrer la mitose asymétrique des cellules souches germinales femelles (GSC) à l'intérieur de leur niche, sans perturbation biologique apparente. Pour ce faire, nous utilisons des germariums exprimant de manière ubiquitaire la protéine GFP::Par-1, qui permet de distinguer cinq morphologies distinctes du spectrosome au cours du cycle cellulaire des GSC : ronde, bouchon, barre, fusion et point d'exclamation (Figure 1B,C). De manière plus détaillée, nous avons observé que le signal intense de GFP::Par-1 du spectrosome rond en phase G2 (Figure 1C, panneau a) est fortement réduit durant les phases G2-M-G1. Importamment, l'utilisation de cette lignée transgénique permet également de visualiser l'entrée des GSC en mitose, puisque la majeure partie de la GFP::Par-1 quitte le spectrosome et remplit le cytoplasme au début de la prophase (Figure 1C, panneau b). En outre, la GFP::Par-1 cytoplasmique permet la détection précise de l'étape de perméabilisation de l'enveloppe nucléaire (NEP)8,14, moment auquel le signal GFP pénètre dans le nucléoplasme (Figure 1C, panneau b). Après la mitose et la reformation de l'enveloppe nucléaire, le signal GFP::Par-1 est progressivement rétabli dans le spectrosome rond en phase G1 (Figure 1C, panneau c). L'ajout de novo de GFP::Par-1 au spectrosome rond en phase G1 favorise la formation des morphologies de spectrosome en bouchon (Figure 1C, panneau d), en barre (Figure 1C, panneau e) et en fusion (Figure 1C, panneau f). Enfin, le marqueur GFP::Par-1 permet de visualiser le spectrosome en point d'exclamation (Figure 1C, panneau e), conséquence de la formation du corps médian, une structure protéique riche en microtubules formée durant la cytocinèse en plus de l'anneau contractile d'actomyosine.
<img alt="Phases de la différenciation des cellules souches germinales ; morphologie du spectrosome ; diagramme des phases du cycle cellulaire ; microscopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Dynamique du cycle du spectrosome dans les cellules souches germinales vivantes. (A) Schéma du compartiment des cellules souches germinales (CSG, en jaune), composé des cellules du filament terminal (TFC, en bleu), de la cellule de transition (TC, en rouge), des cellules cap (CpCs, en violet) et des cellules d’accompagnement (ECs, en gris). Les CSG contiennent un organite caractéristique appelé spectrosome (en vert). Au cours du cycle cellulaire des CSG, le spectrosome passe d’une forme sphérique à une forme allongée, puis redevient sphérique. La CSG se divise pour produire une cellule fille, le cybastoblaste (CB, en orange), qui perd le contact avec le compartiment et contient également un spectrosome sphérique. Le CB se divise quatre fois de manière consécutive et synchrone, avec une cytokinèse incomplète, pour produire des cystes de 2, 4, 8 et 16 cellules reliées entre elles par le fusome. (B) Schéma représentant les différentes formes du spectrosome observées au cours du cycle cellulaire. (B') Durée prévue d’observation des morphologies du spectrosome. (C) Images prises à différents temps lors d’un film de 17 h montrant le signal GFP::Par-1 dans le compartiment des CSG. Le temps 0 min (0') correspond à la perméabilisation de l’enveloppe nucléaire (NEP). Le panneau illustre cinq morphologies différentes du spectrosome (flèches blanches et vertes) : ronde (en G2 et en G1 ; panneaux a et c), bouchon (panneau d), barre (panneau e), en fusion (panneau f) et point d’exclamation (panneau e, flèche verte). Cette dernière morphologie du spectrosome appartient à la deuxième CSG (ligne pointillée verte) observée à 70'. Les CSG sont délimitées par des lignes pointillées jaunes et vertes. Les CB résultant de la division des CSG sont délimités par des lignes pointillées oranges. Échelle : 10 µm. Les panneaux A et B ont été adaptés avec autorisation à partir de Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma d'isolement des ovarioles de Drosophila ; étapes : préparation MatTek, dissection, imagerie ; méthode en biologie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Méthode de montage de l'adhésif Cell-Tak pour l'imagerie vivante prolongée des germariums de Drosophila. (1) Procédure étape par étape pour préparer la boîte avec fond en verre à l'aide de l'adhésif. (2) Aperçu de la dissection des ovaires de Drosophila dans une solution de Ringer et de la préparation des ovarioles individuelles dépourvues de muscles. (3) Transférer les ovarioles sans gaine musculaire dans la boîte avec fond en verre. (4) Remplir la boîte avec fond en verre de milieu de Schneider supplémenté. (5) Imager les germariums pendant 10 à 16 heures à l’aide d’un microscope confocal inversé. Cette figure a été adaptée avec autorisation à partir de Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

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