Name: Imagerie tridimensionnelle des tissus de l’aorte dans l’athérosclérose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Découvrez l'imagerie 3D des tissus aortiques pour l'athérosclérose chez la souris. Cette méthode par clarification tissulaire et microscopie multiphoton révèle les interactions nerve-plaque et progresse la recherche cardiovasculaire.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocoles optimisés de nettoyage des tissus pour l’imagerie 3D de l’aorte murine

<ol><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+landscape+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The changing landscape of atherosclerosis.</a> Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).</li>
<li>Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta+atherosclerosis+lesion+analysis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice.</a> Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).</li>
<li>Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery+tertiary+lymphoid+organs%3A+Powerhouses+of+atherosclerosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity.</a> Front Immunol. 7, 387(2016).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery+tertiary+lymphoid+organs+contribute+to+innate+and+adaptive+immune+responses+in+advanced+mouse+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis.</a> Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).</li>
<li>Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+mechanisms+of+nerve+and+blood+vessel+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring.</a> Nature. 436 (7048), 193-200 (2005).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+cardiovascular+interfaces+control+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis.</a> Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular brain circuits.</a> Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).</li>
<li>Hu, D., Yin, C., Luo, S., Habenicht, A. J. R., Mohanta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+contribute+to+atherosclerosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells contribute to atherosclerosis immunity.</a> Front Immunol. 10, 1101(2019).</li>
<li>Newland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-2+innate+lymphoid+cells+control+the+development+of+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Type-2 innate lymphoid cells control the development of atherosclerosis in mice.</a> Nat Commun. 8, 15781(2017).</li>
<li>Grabner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+promotes+tertiary+lymphoid+organogenesis+in+the+aorta+adventitia+of+aged+Apoe-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice.</a> J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).</li>
<li>Mai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+cellular+mapping+in+mouse+using+standard+igg+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Whole-body cellular mapping in mouse using standard igg antibodies.</a> Nat Biotechnol. 42 (4), 617-627 (2024).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+disco+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A guidebook for disco tissue clearing.</a> Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+technique%3A+Recent+progress+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> J Anat. 238 (2), 489-507 (2021).</li>
<li>Adolfs, Y., Raj, D. D. A., Brignani, S., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+tissue+clearing+and+3d+analysis+of+dopamine+neurons+in+the+developing+mouse+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for tissue clearing and 3d analysis of dopamine neurons in the developing mouse midbrain.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100669(2021).</li>
<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+approaches+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing approaches in atherosclerosis.</a> Methods Mol Biol. 2419, 747-763 (2022).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Ashwell, K. W., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+the+arterial+wall+and+its+modification+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Auton+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Innervation of the arterial wall and its modification in atherosclerosis.</a> Auton Neurosci. 193, 7-11 (2015).</li>
<li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Mol Metab. 14, 71-81 (2018).</li>
<li>Kirst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+fine-scale+organization+and+plasticity+of+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the fine-scale organization and plasticity of the brain vasculature.</a> Cell. 180 (4), 780-795.e25 (2020).</li>
<li>Todorov, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+analysis+of+whole+mouse+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature.</a> Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).</li>
<li>Bhatia, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics+in+three-dimensional+intact+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens.</a> Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).</li>
<li>Mai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+tissue+labeling+and+clearing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs.</a> Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,2'-thiodiéthanol (TDE)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>166782</td><td>réactif de clarification</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>logiciel de visualisation 3D ; Logiciel de traitement d’images utilisé pour la segmentation manuelle et le traçage dans les images 3D</td></tr><tr><td>Alcool benzylique</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>W213713</td><td>Réactif d’élimination</td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630</td><td>Réactif d’élimination</td></tr><tr><td>CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-82</td><td>Solution bloquante</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser&nbsp ;</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS-SP8 3X</td><td>Appareil d’imagerie pour l’imagerie multidimensionnelle haute résolution de tissus biologiques intacts ou de coupes avec une haute spécificité à résolution subcellulaire.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Marqueur de noyaux</td></tr><tr><td>Dichlorométhane (DCM)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>270997</td><td>Réactif nettoyant</td></tr><tr><td>Dissection de la cire pan-noire&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>S17432</td><td>Dissection et fixation de l’aorte&nbsp ;</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope de dissection</td><td>Leica Microsystems&nbsp ;</td><td>Stemi 2000</td><td>Dissection d’organes</td></tr><tr><td>de souris Éthanol&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Défection</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Roth&nbsp ;</td><td>8040.1</td><td>Tampon de perfusion&nbsp ;</td></tr><tr><td>Fidji&nbsp ;</td><td>(ImageJ, NIH)</td><td></td><td>Logiciel de traitement d’images open source pour les images 2D et 3D</td></tr><tr><td>Chèvre anti-hamster IgG, Cy3</td><td>Dianova&nbsp ;</td><td>127-165-099</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Chèvre anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>A-21109</td><td>Anticorps secondaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chèvre anti-Rat IgG, Cy5</td><td>Dianova</td><td>712-175-150</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Hamster Anti-CD3e&nbsp ;</td><td>BD Bioscience</td><td>145-2C11&nbsp ;</td><td>Marqueur de cellules Pan-T</td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging, Pays-Bas</td><td>Version 19.10</td><td>Logiciel de restauration d’images ; Logiciel de traitement d’images utilisé principalement pour la déconvolution d’images 2D et 3D Poste de</td></tr><tr><td>travail de traitement d’images</td><td>MIFCOM&nbsp ;</td>Station de traitement d’images <td>MIFCOM X5</td><td>équipée de tous les logiciels de traitement d’images, y compris la suite d’applications Leica X, Fiji et Imaris pour le post-traitement des images acquises par microscopes confocaux, multiphotoniques et à feuillets de lumière</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>Version 8.4</td><td>Logiciel d’analyse d’images ; Logiciel de traitement d’images utilisé pour la segmentation automatisée d’images 3D</td></tr><tr><td>Incubateur et rotateur&nbsp ;</td><td>Marshall Scientific&nbsp ;</td><td>Innova 4230</td><td>Dispositif d’incubation et de rotation pendant l’élimination des tissus </td></tr><tr><td>iSpacer</td><td>Sunjin Lab</td><td>IS4020</td><td>Rectangulaire ainsi que le porte-échantillon</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Livisto</td><td></td><td>Anesthésique</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS-X)&nbsp ;</td><td>Leica Microsystems</td><td>Version 3.5</td><td>Logiciel de traitement d’images pour les images acquises avec le microscope Leica</td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM LB</td><td>Appareil d’imagerie pour l’imagerie lumineuse stratifiée</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>LaVision BioTech</td><td>Ultramicroscope II</td><td>Technique d’imagerie pour l’imagerie rapide et haute résolution de grands spécimens biologiques ou de souris entières avec une faible exposition à la lumière en acquérant rapidement des images de coupes optiques minces.</td></tr><tr><td>Microscopie multiphotonique</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS-SP5II MP&nbsp ;</td><td>Modalité d’imagerie pour l’imagerie multidimensionnelle à haute résolution de tissus biologiques intacts et viables au niveau subcellulaire et moléculaire sur des périodes prolongées, profondément dans l’échantillon et avec une invasion minimale.</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Solution bloquante</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P-6148&nbsp ;</td><td>Fixation&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P4417-100TAB&nbsp ;</td><td>Tampon de lavage</td></tr><tr><td>Gélatine de peau de porc</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>G1890</td><td>Tampon d’incubation</td></tr><tr><td>Quadrol</td><td>Sigma</td><td>122262</td><td>CUBIC réactif d’élimination</td></tr><tr><td>Lapin Anti-NF200</td><td>Sigma</td><td>N4142</td><td>Marqueur pan-neuronal</td></tr><tr><td>Rat Anti-B220&nbsp ;</td><td>BD Bioscience</td><td>RA3-6B2</td><td>Marqueur de cellules Pan-B</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>90M003524V&nbsp ;</td><td>Déshydratation</td></tr><tr><td>Sytox</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11380</td><td>Marqueur de noyaux</td></tr><tr><td>Tétrahydrofurane</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>401757</td><td>Réactif de nettoyage&nbsp ;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth&nbsp ;</td><td>3051.1</td><td></td></tr><tr><td>Pénétration de l’urée</td><td>sigma&nbsp ;</td><td>U5128</td><td>CUBIC réactif de clarification</td></tr><tr><td>Xylène&nbsp ;</td><td>Fisher Chemical&nbsp ;</td><td>x/0250/17&nbsp ;</td><td>Anesthésique&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

imagerie tridimensionnelle des tissus de l’aorte dans l’athérosclérose

Three-Dimensional Imaging of Aortic Tissues in Atherosclerosis

Pour démontrer la microanatomie de l’aorte intacte saine et malade et pour révéler les connectivités physiques entre le système immunitaire, le système nerveux et le système cardiovasculaire dans des modèles murins d’athérosclérose, nous avons utilisé deux approches complémentaires de clarification tissulaire : la clarification TDE de l’aorte isolée et la clarification iDISCO de la souris entière (Figure 1). Après une immunocoloration complète, l’aorte endofaciale a été éliminée avec une série de solutions de travail TDE. L’IR est apparié à 1,4-1,5, en fonction de la concentration TDE de l’étape finale, pour obtenir une transparence optimale du tissu aortique sans modifier son volume (Figure 1A). Contrairement à la clairance TDE, le protocole de clarification iDISCO comprend des étapes de décoloration et de perméabilisation avant l’immunocoloration complète, suivies d’une délipidation et d’une déshydratation à l’aide de différents solvants chimiques, et de l’appariement RI à 1,56 (Figure 1B). Le dégagement iDISCO permet de visualiser des tissus de grande taille et même l’ensemble du corps de la souris en raison du rétrécissement du tissu.
L’imagerie 3D confocale et multiphotonique de l’aorte intégrale en face nettoyée par TDE permet de visualiser les structures, y compris les plaques intimales, la cellularité de l’adventice et les projections neuronales de l’adventice, entre autres structures, tandis que l’imagerie par feuillet de lumière de la souris dégagée iDISCO permet la visualisation et la reconstruction de l’arbre artériel ainsi que du tissu adipeux périvasculaire, des ganglions lymphatiques rénaux et des composants neuronaux associés, y compris les nerfs et les ganglions (Figure 1C). Par exemple, l’imagerie confocale de l’aorte athéroscléreuse éliminée par TDE a détecté plusieurs lymphocytes T colorés au CD3e dans la plaque et une néogenèse étendue de fibres nerveuses colorées à NF200 de différents diamètres dans les ATLO, tandis que l’imagerie multiphotonique de l’aorte abdominale malade du mont entier éliminée par TDE de souris Apoe-/- âgées a montré la territorialité de la germination axonale exprimant NF200 dans les zones de lymphocytes T négatifs B220 au sein des ATLO (Figure 2A). À l’inverse, l’imagerie à feuillet lumineux d’iDISCO a permis de visualiser la relation spatiale entre l’aorte et les ganglions sympathiques adjacents. La segmentation et le traçage d’images 3D d’axones individuels des ganglions à la surface aortique ont révélé une restructuration neuronale robuste, y compris des axones nouvellement formés et colorés à la NF200 dans l’aorte adventice adjacente à la plaque d’athérosclérose (Figure 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67400/67400fig01.jpg"> 
Figure 1 : Déroulement de l’étude. (A) Élimination aqueuse de l’aorte face à l’EDT. (B) Nettoyage iDISCO à base de solvant de la souris entière. (C). 3D l’imagerie volumétrique et le traitement d’images d’échantillons isolés d’aorte ou de souris entières optiquement clairs. Cette figure a été modifiée avec la permission de Sun et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67400/67400fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67400/67400fig02v2.jpg"> 
Figure 2 : Exemple d’images 3D de tissus éliminés par TDE et iDISCO. (A) Imagerie 3D de TDE éliminé dans l’aorte faciale. Panneau supérieur : Les images confocales ont montré des lymphocytes T CD3e+ (rouge, flèche) dans la plaque intimale et des axones nerveux NF200+ (vert) dans l’aorte adventice athéroscléreuse (ATLO) ; Panneau inférieur : Des images multiphotoniques ont montré des axones nerveux NF200+ (vert, pointes de flèches), des lymphocytes B B220+ (rouge, triangle ouvert), une génération de seconde harmonique dérivée du collagène (SHG, blanc) chez des souris Apoe-/- mâles de 78 semaines. Sytox (en bleu) et DAPI (en bleu) ont montré les noyaux. (B) Des images 3D reconstruites et segmentées d’iDISCO ont dégagé tout l’abdomen de la souris. Reconstruction, segmentation et traçage en 3D des nerfs et axones NF200+ (flèches, vert) et leur relation spatiale avec les ganglions sympathiques (pointes de flèches) de l’aorte abdominale intacte. Un triangle ouvert indiquait un axone nouvellement formé adjacent à des plaques d’athérosclérose. L’autofluorescence (auto) a été utilisée pour imager l’aorte et le tissu conjonctif, y compris la plaque (cyan) et le ganglion lymphatique rénal (RLN, bleu). CG, ganglions cœliaques, SycG, ganglions de la chaîne sympathique. Cette figure a été modifiée avec la permission de Mohanta et al.6 et de Sun et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67400/67400fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Imagerie tridimensionnelle des tissus de l’aorte dans l’athérosclérose

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