Name: La glycoprotéomique guidée par Glycomics facilite le profilage complet du glycoprotéome dans les microenvironnements tumoraux complexes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Découvrez la méthode de glycoprotéomique guidée par glycomique pour le profilage complet du glycoprotéome dans les microenvironnements tumoraux complexes. Cette approche intégrée permet d'obtenir des informations précises sur les glycoprotéines.

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<meta charset="utf8"></head><body>Profilage des tissus du cancer colorectal à l’aide de la glycoprotéomique guidée par Glycomics

La glycosylation des protéines est un type répandu et complexe de modification co- et post-traductionnelle des protéines produites par les espèces à travers l’arbre phylogénétique de lavie1,2,3. Les glycanes liés aux protéines sont connus pour avoir un impact sur un large éventail de processus biologiques importants pour la santé humaine, y compris la médiation et la régulation des interactions cellulaires et des événements de communication 4,5. On a pensé que la glycosylation aberrante des protéines était une cause de transformation maligne, de progression tumorale et de propagation 6,7,8. Cela implique les glycanes dans des processus tumorigènes clés dans le microenvironnement tumoral (TME) et offre un potentiel considérable et largement inexploité pour la découverte de biomarqueurs à base de glycanes et d’applications thérapeutiques. La glycobiologie fait donc l’objet d’une attention croissante dans la recherche sur le cancer et dans les sciences de la vie9.
S’appuyant sur les développements clés de la glycoanalytique et de l’informatique au cours de la dernière décennie 10,11,12,13,14,15,16,17, la glycomique et la glycoprotéomique pilotées par chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) ont été établies comme des outils puissants pour le profilage à l’échelle du système de glycanes libérés et de glycopeptides intacts à partir de mélanges complexes de glycoprotéines extraites directement de leurs origines d’échantillons biologiques, telles que divers types d’échantillons de patients cancéreux (par exemple, tissus tumoraux, populations cellulaires, fluides corporels)3,13,18,19,20.
La glycomique fournit des informations sur la structure et la quantité du répertoire de glycanes (le glycome), qui est produit dynamiquement par les cellules, les tissus et même des organismes entiers. D’autre part, la glycoprotéomique fournit des informations quantitatives sur les transporteurs de protéines et leur(s) site(s) de glycosylation, les taux d’occupation du site (macro-hétérogénéité), les compositions de glycanes spécifiques au site et leur modèle de distribution de site (micro-hétérogénéité) avec des informations structurelles limitées sur les glycanes (souvent limitées à la composition des glycanes)15,16,21. Par conséquent, la glycomique et la glycoprotéomique sont des approches complémentaires pour étudier les détails biochimiques du glycoprotéome22.
Une myriade de modèles méthodologiques et de stratégies analytiques pour la glycomique et la glycoprotéomique ont été élaborés et appliqués dans tous les laboratoires en fonction du glycoanalyte d’intérêt (p. ex., lié à N-/O-/C, glycane/glycopeptide/glycoprotéine, étiqueté/non marqué), de la nature de l’échantillon (p. ex., cellules, tissus, fluides corporels), de la quantité (niveaux de protéines nanogrammes/microgrammes/milligrammes) et de l’instrument d’analyse disponible23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Malgré les avantages reconnus de leur utilisation parallèle, la glycomique et la glycoprotéomique ne sont pas couramment appliquées ensemble, mais plutôt en tant qu’approches autonomes dans les études de recherche sur la glycobiologie et le cancer en raison de leur forte demande d’expertise analytique et d’instrumentation spécialisée.
Reconnaissant cette lacune technologique, il y a plus de dix ans, nous avons introduit la méthode de glycoprotéomique assistée par glycomique, qui est capable d’intégrer les données glycomiques et glycoprotéomiques obtenues à partir d’échantillons biologiques complexes33. En bref, la technologie glycoprotéomique assistée par glycomique (ou guidée par la glycomique comme dans ce protocole) établit le profil des N- et/ou O-glycanes à travers une méthode LC-MS/MS à carbone graphitisé poreux (PGC) ÉTABLIE34,35, qui sont ensuite utilisées pour l’analyse des données intactes de N- et/ou O-glycopeptide acquises à partir du ou des mêmes échantillons en définissant les limites de l’espace de recherche des glycanes36. PGC-LC-MS/MS est une méthode glycomique particulièrement puissante car elle fournit un aperçu quantitatif du glycome avec une sensibilité et une résolution structurelle élevées, fournissant des informations sur la topologie (séquence monosaccharidique et motif de ramification) et les liaisons glycosidiques des glycanes, même au sein de mélanges complexes 35,37,38. Le flux de travail glycoprotéomique implique la génération de peptides, le marquage facultatif des peptides, le multiplexage et la préfractionnement, ainsi que l’enrichissement avant l’analyse LC-MS/MS en phase inverse qui utilise idéalement différentes méthodes de fragmentation, notamment la dissociation collisionnelle par paliers, y compris la dissociation collisionnelle à énergie de collision/haute énergie (sceHCD, pour les N-glycopeptides) et le transfert d’électrons/dissociation collisionnelle à haute énergie (EThcD, pour les O-glycopeptides) pour l’identification des analytes. Pour l’analyse du N-glycoprotéome, la dé-N-glycoprotéomique parallèle peut guider l’analyse des données de N-glycopeptide intact en définissant l’espace de recherche protéine/peptide et en fournissant plus de détails sur les sites de N-glycosylation occupés et leur taux d’occupation du site, tandis que l’analyse parallèle des peptides non modifiés révèle tout changement de niveau de protéine entre les conditions étudiées.
Cet article fournit un protocole étape par étape détaillé et facile à suivre pour la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique (voir la figure 1 pour une vue d’ensemble du flux de travail). Le protocole fournit des détails expérimentaux sur les étapes de préparation des échantillons et les expériences de glycomique et de glycoprotéomique basées sur LC-MS/MS et présente des résultats représentatifs démontrant l’application de la méthode à des coupes de tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) de tumeurs réséquées chez des patients atteints de cancer colorectal (CRC), permettant d’obtenir des informations sur la glycobiologie du TME dans un type d’échantillon précieux qui est archivé dans des biobanques de cancer du monde entier. L’analyse et l’intégration des données glycomiques et glycoprotéomiques sont également brièvement abordées.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg"> 
Figure 1 : Vue d’ensemble de la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique. La vue d’ensemble présente les étapes expérimentales détaillées des flux de travail glycomiques (à gauche) et glycoprotéomique (à droite), avec une vue d’ensemble des informations obtenues (en gras) et de la manière dont les deux approches sont intégrées grâce à une analyse et une interprétation améliorées des données. Insertion : Micro-colonnes SPE faites maison utilisées pour les flux de travail (i) glycomiques et (ii-iii) glycoprotéomiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acétate&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium, pureté &ge ; 99.0 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Acétonitrile anhydre (ACN), grade LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Fétiine bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Acide formique, grade LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Acide acétique glaciaire</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Iodoacétamide (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/&mu ; L) exprimée de manière recombinante chez Escherichia coli</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone 40 (PVP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484016</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Trypsine porcine de qualité séquençage&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Borohydrure de sodium (NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), grade LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA), grade LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Tools/Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 disques</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>Disques C8</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond plat en polypropylène 96 puits&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3364</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ membrane en polydifluorure de vinylidène (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td>Taille des pores : 0,45 &mu ; m&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Adaptateurs de microcentrifugeuse&nbsp ;</td><td>Le collier de colonne Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td><td>MiniSpin, est livré avec des colonnes Microspin</td></tr><tr><td>Oligo R3 résine Thermo</td><td></td><td>1133903</td><td>taille de particule 30 &mu ; m</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm</td><td>M PM996</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Protein LoBind 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Protein LoBind 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Safe-lock 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Safe-lock 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>5382000066</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Perforateur monotrou</td><td>Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur SpeedVac</td><td>Martin Christ</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Supelclean ENVI-Carb SPE résine</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>Granulométrie 120-400 mesh. La résine peut être extraite manuellement des cartouches et peut être stockée à long terme dans du méthanol à 50 % (v/v) dans de l’eau MilliQ</td></tr><tr><td>Seringue 5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z116866</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Incubateur à température contrôlée</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Bain à ultrasons</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Résine ZIC-HILIC</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>Taille des particules/pores, 5 &mu ; m/200 &Aring ;. La résine peut être extraite manuellement de la colonne LC et peut être stockée à long terme dans du méthanol à 50 % (v/v) dans de l’eau MilliQ</td></tr><tr><td>Micro-colonnes d’extraction en phase solide (SPE) ZipTip C18&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>Alternativement, des micro-colonnes C18-SPE faites maison peuvent remplacer le produit commercial</td></tr><tr><td>LC-MS/MS Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Système HPLC capillaire Infinity&nbsp ;</td><td>Agilent</td><td></td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Colonne LC analytique pré-emballée avec la résine ReproSil-Pur C18 AQ</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Allemagne</td><td>r13.aq.s2570</td><td>Taille des particules/pores : 3 &mu ; m/120 &�nbsp ;, longueur/diamètre intérieur : 25 cm/75 &mu ;m. Des colonnes nano-LC C18 commerciales sont également disponibles.</td></tr><tr><td>Système Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC&nbsp ;</td><td>Thermo</td><td></td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>HyperCarb KAPPA PGC colonne LC</td> capillaire<td>Thermo</td><td>Discontinued</td><td>Taille des particules/pores, 3 &mu ; m/250 &Aring ;; longueur de la colonne, 30 mm ; diamètre intérieur, 0,180 mm. Des géométries plus grandes des colonnes HyperCarb PGC-LC, produisant des données de qualité similaire, sont disponibles dans le commerce (par exemple, Thermo #35003-031030). Colonne SupelTMCarb LC de Merck avec une taille de particule/pore de 2,7 & m/200 et avec différentes longueurs de colonne et diamètres intérieurs sont également disponibles (par exemple, Merck #59994-U).&nbsp ;</td></tr><tr>Acétonitrile <td>LiChrosolv</td><td></td> <td>de qualité LCMS</td><td>100029 alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse à piège linéaire quadripolaire (LTQ) Spectromètre de masse à piège à ions Velos Pro (glycomique)&nbsp ;</td><td>Alternatives thermiques</td><td></td><td>disponibles</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (glycoprotéomique)</td><td>Thermo</td><td></td><td>D’autres systèmes MS haute résolution avec ou sans ETD (uniquement requis pour l’O-glycoprotéomique) sont également disponibles (par exemple, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker ou spectromètres de masse haute performance similaires d’autres fournisseurs)</td></tr><tr><td>Total Recovery Flacons à vis en verre transparent 0,9 mL</td><td>Thermo</td><td>THC11093563</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Récupération totale Flacons à vis en verre transparent Bouchons assortis</td><td>Thermo</td><td>THC09150869</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Piège LC Colonne emballée en interne avec de la résine ReproSil-Pur C18 AQ&nbsp ;</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Allemagne</td><td>r15.aq.s0202</td><td>Taille des particules/pores : 5 &mu ; m/120 &Aring ;, longueur/diamètre intérieur : 2 cm/100 &mu ;m. Des colonnes LC de piège C18 commerciales sont également disponibles.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v2.6.46 ou supérieur</td><td>Moteur de recherche commercial de glycopeptides et de PTM, acceptant les données brutes LC-MS/MS de la plupart des fournisseurs de MS Byos</td></tr><tr><td></td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v3.9-7 ou supérieur</td><td>Logiciel commercial pour l’inspection manuelle des candidats glycopeptides et l’annotation automatique des spectres MS/MS de glycanes</td></tr><tr><td>GlycoMod</td><td>Expasy</td><td></td><td>Logiciel en libre accès, aide à l’annotation des données glycomiques (https://web.expasy.org/glycomod/)</td></tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>Logiciel en libre accès, aide à l’annotation des données glycomiques et au dessin de dessins animés de glycanes</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>Logiciel en libre accès, extraction m/z d’ions précurseurs de glycanes à partir de données spectrales brutes</td></tr><tr><td>Skyline</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2 ou supérieur</td><td>Logiciel en libre accès pour la quantification relative des glycanes</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2 ou supérieur</td><td>Pour la navigation dans les données brutes LC-MS/MS</td></tr></tbody></table>

la glycoprotéomique guidée par glycomics facilite le profilage complet du glycoprotéome dans les microenvironnements tumoraux complexes 

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Des résultats représentatifs de la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique appliquée à une lame de tissu FFPE provenant d’un patient souffrant de CCR au stade II sont fournis dans cette section.
Afin d’obtenir suffisamment de matériel de départ protéique pour le protocole, des extraits de protéines provenant de deux lames (piles z) ont été combinés à partir du même bloc de tissu FFPE conformément à un protocole publié et une approche de marquage TMT a été appliquée pour augmenter ...

La glycoprotéomique guidée par Glycomics facilite le profilage complet du glycoprotéome dans les microenvironnements tumoraux complexes 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

glycomics-guided-glycoproteomics-facilitates-comprehensive-profiling

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