Name: Dosage quantitatif basé sur la PCR pour mesurer la signalisation Sonic Hedgehog dans un modèle cellulaire de ciliogenèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Apprenez à quantifier la signalisation Sonic Hedgehog par PCR dans des cellules RPE-1 ciliées. Cette méthode sensible permet d'évaluer les altérations génétiques et épigénétiques liées à la dysfonction des cils primaires.

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<ol><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrioles%2C+centrosomes%2C+and+cilia+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li>
<li>Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeing+the+brake%3A+Proliferation+needs+primary+cilium+to+disassemble%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci%22%5BJournal%5D)">Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble.</a> J Biosci. 45, 117(2020).</li>
<li>Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+is+deeply+integrated+in+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling.</a> Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).</li>
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<li>Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+mechanistic+understanding+of+cilia+function+in+cellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).</li>
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<li>Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signalling+by+primary+cilia+in+development%2C+organ+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease.</a> Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).</li>
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<li>Merrill, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+abnormalities+due+to+defects+in+the+retrograde+transport+protein+dync2h1+in+short-rib+polydactyly+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome.</a> Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).</li>
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<li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vdac3+and+mps1+negatively+regulate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).</li>
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<li>Wong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+can+both+mediate+and+suppress+hedgehog+pathway-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis.</a> Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).</li>
<li>Deshpande, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoothened+stimulation+by+membrane+sterols+drives+hedgehog+pathway+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity.</a> Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).</li>
<li>Mukhopadhyay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+g-protein-coupled+receptor+gpr161+negatively+regulates+the+sonic+hedgehog+pathway+via+camp+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling.</a> Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).</li>
<li>Niewiadomski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli+protein+activity+is+controlled+by+multisite+phosphorylation+in+vertebrate+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling.</a> Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).</li>
<li>Kovacs, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-arrestin-mediated+localization+of+smoothened+to+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium.</a> Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).</li>
<li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin-4+protein+kif7+regulates+mammalian+hedgehog+signalling+by+organizing+the+cilium+tip+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).</li>
<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hedgehog-dependent+full-length+gli3+accumulation+in+primary+cilia+and+subsequent+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation.</a> Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).</li>
<li>Griffiths, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-interacting+protein+is+a+multimodal+antagonist+of+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling.</a> Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).</li>
<li>Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+cilia+characteristics+and+hedgehog+signaling+in+five+immortal+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines.</a> PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).</li>
<li>Schmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+shh+signaling+impairments+in+human+and+mouse+models+of+parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease.</a> Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).</li>
<li>Dutta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+primary+cilia+number+and+length+upon+vdac1+depletion+contributes+to+attenuated+proliferation+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells.</a> Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).</li>
<li>De, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+of+cdh1+in+glioblastoma+cancer+stem+cells+attenuates+apc%2Fc%28cdh1%29+activity+and+pharmacologic+inhibition+of+apc%2Fc%28cdh1%2Fcdc20%29+compromises+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability.</a> Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).</li>
<li>Yang, S., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunofluorescence-based+detection+of+hedgehog+pathway+components+in+primary+cilia+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mir-669a-5p%2Fg3bp%2Fhdac6%2Fakap12+axis+regulates+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length.</a> Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).</li>
<li>Alanazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+roles+of+mir-17+in+ciliogenesis+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle.</a> Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miqe+guidelines%3A+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+pcr+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMSO, filtre stérile</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Âne, anti-IgG souris (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Âne, anti-Lapin IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td>Microscope à fluorescence <td>Himedia</td><td>RM1112</td><td></td></tr><tr><td>équipé d’un objectif 60X</td><td>Carl Zeiss.</td><td></td><td>Axio observer colibri 5</td></tr><tr><td>cellules hTERT-RPE1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>iScript kit de synthèse d’ADNc</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>souris, anticorps monoclonal anti-tubuline acétylée</td><td>Milipore Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>Dilution finale 1:1000</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine, 100X</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Appareil de PCR quantitative, CFX 96</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lapin, anticorps polyclonal Arl13B</td><td>ProteinTech</td><td>17711-1-AP</td><td>Dilution finale 1:250</td></tr><tr><td>Lapin, polyclonal Cep135</td><td>anticorps ProteinTech</td><td>24428-1-AP</td><td>Dilution finale 1:500</td></tr><tr><td>SlowFade gold Antifade moutant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S36940</td><td></td></tr><tr><td>Smoothened Agoniste (SAG)&nbsp ;</td><td>Abmole</td><td>M4865</td><td>Solution mère : dans DMSO, 5 mM</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories 1725271</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Reagent Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12605028</td><td></td></tr></tbody></table>

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