Name: Imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique unicellulaire avec Fura-2/AM pour étudier l'activation des canaux ioniques TRPV1 dans les kératinocytes et cellules HEK293T. Cette méthode permet le suivi quantitatif en temps réel des concentrations de calcium intracellulaire.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imagerie calcique unicellulaire pour les études d’activation des canaux

<ol><li>Murthy, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+for+contraction+and+relaxation+in+smooth+muscle+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut.</a> Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).</li>
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<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stim1+thermosensitivity+defines+the+optimal+preference+temperature+for+warm+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Stim1 thermosensitivity defines the optimal preference temperature for warm sensation in mice.</a> Cell Res. 29 (2), 95-109 (2019).</li>
<li>Bharate, S. S., Bharate, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+thermoreceptor+trpm8+by+cooling+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modulation of thermoreceptor trpm8 by cooling compounds.</a> ACS Chem Neurosci. 3 (4), 248-267 (2012).</li>
<li>Coste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo+proteins+are+pore-forming+subunits+of+mechanically+activated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels.</a> Nature. 483 (7388), 176-181 (2012).</li>
<li>Behera, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+dynamics+using+a+ubiquitin-10+promoter-driven+yellow+cameleon+3.6+indicator+reveal+reliable+transgene+expression+and+differences+in+cytoplasmic+Ca2%2B+responses+in+arabidopsis+and+rice+%28oryza+sativa%29+roots%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ dynamics using a ubiquitin-10 promoter-driven yellow cameleon 3.6 indicator reveal reliable transgene expression and differences in cytoplasmic Ca2+ responses in arabidopsis and rice (oryza sativa) roots.</a> New Phytol. 206 (2), 751-760 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+analysis+of+stim1+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism analysis of stim1 thermal sensation.</a> Cells. 12 (22), 2613(2023).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+safeguards+organelle+homeostasis+and+cellular+aging+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells.</a> Cell Discov. 4, 2(2018).</li>
<li>Jiang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensitive+piezo1+channel+mediates+heart+mechano-chemo+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction.</a> Nat Commun. 12 (1), 869(2021).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Orai1-mediated+store-operated+Ca%282%2B%29+channel%2Fcalpain+signaling+contributes+to+high+glucose-induced+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury.</a> J Biol Chem. 298 (6), 101990(2022).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+er+ion+homeostasis+maintained+by+an+er+anion+channel+clcc1+contributes+to+als-like+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies.</a> Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).</li>
<li>Gouin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv1+and+trpa1+in+cutaneous+neurogenic+and+chronic+inflammation%3A+Pro-inflammatory+response+induced+by+their+activation+and+their+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization.</a> Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+fura-2+am%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am.</a> J Vis Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lever-like+transduction+pathway+for+long-distance+chemical-+and+mechano-gating+of+the+mechanosensitive+piezo1+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel.</a> Nat Commun. 9 (1), 1300(2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Appareil photo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsaicine</td><td>Sigma</td><td>211275</td><td></td></tr><tr><td>CL-100 régulateur de température</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide cyclopiazonique (CPA)</td><td>Sigma</td><td>C1530</td><td></td></tr><tr><td>DG-4 lumière</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)&nbsp ;</td><td>Amresco</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie par fluorescence (MetaFluor, Logiciel payant)&nbsp ;</td><td>Dispositifs</td><td></td><td></td>moléculaires</tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>HBSS tampon</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>&nbsp ; Beyotime</td><td>ST501</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-lysine</td><td>&nbsp ; Beyotime</td><td>ST508</td><td></td></tr><tr><td>SC-20 Appareil de chauffage/refroidissement à circulation de liquide&nbsp ;</td>Appareil <td></td><td></td>de <td>Harvard</td></tr><tr><td>Source de lumière blanche</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Détection de la réponse en température 
Kératinocytes primaires Les kératinocytes primaires ont été isolés chez des souris nouveau-nées et préparés selon les protocoles établis10. Ces cellules ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits contenant des lames de verre. Suite à la mise en charge de la sonde Fura-2, la mise au point a été ajustée au microscope à une longueur d’onde de 380 nm pour obtenir une visualisation claire de la morphologie cellulaire, comme illustré à la figure 2A. Si la sonde n’était pas chargée avec succès pendant le processus, les cellules n’étaient pas visibles. Le tampon extracellulaire dans la chambre a été remplacé en continu par un système de perfusion, assurant des conditions optimales pour les cellules. Le système de contrôle de la température était connecté au système de perfusion, ce qui permettait de détecter les réponses thermiques cellulaires en contrôlant les changements de température dans le tampon extracellulaire. Ce processus consistait à chauffer progressivement le tampon extracellulaire, puis à le refroidir progressivement.
Le système d’imagerie Ca2+ unicellulaire a été utilisé pour surveiller les changements de concentration intracellulaire de Ca2+ dans diverses conditions expérimentales. Comme le montre la figure 2B, les kératinocytes ont présenté une réponse thermique distincte lorsqu’ils sont soumis à un chauffage, ainsi qu’une réponse notable pendant la phase de refroidissement. Notamment, cette réponse à la température a disparu lorsque le gène STIM1, qui est principalement responsable de cette réponse, a été supprimé (Figure 2C)10. L’imagerie Ca2+ unicellulaire permet d’observer en temps réel les changements de concentration intracellulaire de Ca2+ en réponse à divers stimuli externes, ce qui permet une analyse détaillée du comportement et de la signalisation cellulaires.
HEK293T cellules surexprimant les plasmides cibles HEK293T cellules ont été ensemencées dans une plaque de 24 puits contenant des lames de verre selon la méthode expérimentale. Les cellules ont ensuite été surexprimées avec STIM1/Orai1, et leur réponse thermique médiée a été détectée à l’aide de la même méthode que celle décrite ci-dessus pour les cellules primaires. Dans le cas de cellules surexprimant le plasmide cible, la transfection réussie a été confirmée par la sélection de cellules exprimant le plasmide correspondant, comme l’indiquent les protéines fluorescentes rouges ou vertes portées par le plasmide sous les longueurs d’onde TRITC ou FITC. Pour cette expérience, les plasmides STIM1-GFP/Orai1-DsRed ont été utilisés, la GFP étant détectée sous FITC, émettant une fluorescence verte, et le DsRed détecté sous TRITC, émettant une fluorescence rouge. Des cellules surexprimant mCherry vide (TRITC) ont été utilisées comme témoins négatifs. Comme le montre la figure 3A, les cellules fluorescentes observées sous FITC ont indiqué une expression réussie de STIM1, permettant de sélectionner et d’enregistrer leur réponse thermique pendant les processus de chauffage et de refroidissement. Les cellules qui n’ont pas été transfectées ont servi de contrôle négatif. La figure 3B montre que STIM1/Orai1 a présenté une réponse thermique significative pendant le processus de refroidissement, contrastant avec le contrôle négatif montré à la figure 3C.
Détection de la réponse aux médicaments La technologie d’imagerie Ca2+ unicellulaire peut également être utilisée pour détecter les réponses cellulaires aux composés. La préparation de la cellule pour la détection de la réponse thermique est la même que celle décrite ci-dessus. La différence entre la réponse médicamenteuse et la réponse thermique réside dans le fait que la réponse thermique nécessite généralement l’activation des cellules en modifiant la température du tampon extracellulaire par le biais d’un système de perfusion, tandis que les composés peuvent être administrés soit par perfusion, soit en les ajoutant directement à l’aide d’une pipette. L’ajout direct à l’aide d’une pipette permet d’économiser efficacement la quantité de composé utilisée ; Cependant, la courbe résultante n’est pas toujours aussi attrayante visuellement que celle obtenue par perfusion.
Si l’on prend l’exemple de la figure 4 , la figure 4A montre la réponse d’entrée calcique opérée par le magasin (SOCE) de STIM1/Orai1, où la concentration extracellulaire de Ca2+ et la teneur en acide cyclopiazonique (CPA) sont modifiées séquentiellement par un système de perfusion pour induire la SOCE. Dans la figure 4B, la capsaïcine, agoniste du TRPV1, est directement ajoutée à l’aide d’une pipette aux cellules surexprimant le plasmide du TRPV1. La capsaïcine peut activer TRPV1 et induire un afflux extracellulaire de Ca2+ .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig01.jpg">
Figure 1 : Schéma de principe de Fura-2 AM. Fura-2 est une sonde de fluorescence Ca2+ couramment utilisée en biologie cellulaire qui se lie sélectivement au Ca2+ dans un rapport de 1:1 et émet de la fluorescence. En raison de sa nature hautement polaire en tant que composé acide, Fura-2 ne peut pas pénétrer dans les cellules. Pour améliorer la perméabilité cellulaire, il est conjugué à de l’acétoxyméthyle (AM) sur son groupe négatif pour former Fura-2/AM. Cette modification augmente sa solubilité ester et élimine la charge négative. À l’intérieur des cellules, Fura-2/AM est hydrolysé par les estérases en Fura-2, qui peut se lier de manière réversible avec le Ca2+ cytoplasmique libre. Lors de la liaison, la longueur d’onde d’excitation maximale passe de 380 nm à 340 nm (lorsqu’elle est saturée de Ca2+). L’intensité de fluorescence émise est quantitativement liée à la concentration de Ca2+ lié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig02.jpg"> 
Figure 2 : Détection de la réponse en température des kératinocytes primaires. (A) Coloration Fura-2 des kératinocytes de souris nouveau-nées, observée sous une lentille d’objectif 20x. (B, C) Réponse en température des kératinocytes WT (B) et des kératinocytes knock-out STIM1 (C) à l’aide d’un système d’imagerie Ca2+ unicellulaire. Grossissement : 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig03.jpg"> 
Figure 3 : Détection de la réponse en température de STIM1-GFP/Orai1-Dsred surexprimée dans HEK293T cellules. (A) Une figure représentative montrant des cellules positives exprimant STIM1-GFP sous FITC. (B, C) Réponse en température de HEK293T cellules exprimant le plasmide respectif détectée par un système d’imagerie Ca2+ unicellulaire. Grossissement : 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig04.jpg"> 
Figure 4 : Détection de la réponse aux médicaments à l’aide de l’imagerie Ca2+ unicellulaire. (A) Réponse SOCE des cellules HEK293T surexprimant STIM1/Orai1. Le tampon extracellulaire passe de Ca2+ à Ca2+ à l’aide d’un système de perfusion. En l’absence de Ca2+, le CPA est ajouté pour épuiser le Ca2+ du réticulum endoplasmique. Le tampon extracellulaire est ensuite remplacé par un tampon contenant du Ca2+ pour induire un afflux extracellulaire de Ca2+ , représentant l’entrée de Ca2+ exploitée en magasin. L’imagerie Ca2+ unicellulaire est utilisée pour enregistrer dynamiquement les changements de concentration cytosolique de Ca2+ induits par ces processus. (B) HEK293T cellules surexprimant TRPV1-mRuby, où mRuby est une protéine fluorescente utilisée pour vérifier l’état de transfection de la protéine TRPV1. La capsaïcine est ajoutée à l’aide d’une pipette tandis que l’afflux de Ca2+ est enregistré par imagerie Ca2+ sur cellule unique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

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