Imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques

Nous avons étudié nos canaux liés à la sensation de température, à la sensation d’âge et à la sensation de douleur. Nous nous intéressons aux activités de criblage de petites molécules dans nos canaux et à l’étude de leurs mécanismes. Nous avons examiné deux agonistes activateurs de TRPV1 et mené une étude détaillée sur leurs mécanismes d’action.

Cette technologie permet une surveillance quantitative et simultanée en temps réel des changements de calcium dans plusieurs cellules, ce qui en fait une approche simple et rapide pour les applications de recherche. Notre objectif est d’explorer le mécanisme de traitement des différentes maladies par la modernisation des canaux ioniques liés au calcium. Pour commencer, préparez des lames de verre stériles de huit millimètres de diamètre et placez-les dans une plaque à 24 puits.

Ajoutez 500 microlitres de tampon Poly-D-lycine dans chaque puits. Incuber les lames à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre le revêtement. Ensuite, à l’aide d’une pipette, jetez la solution d’enrobage de chaque puits.

Lavez les lames une fois avec le PBS de Dulbecco et mettez les lames lavées de côté pour une utilisation ultérieure. Ensemencez les cellules sur la plaque préparée à 24 puits à une densité d’environ 1,5 fois 10 à la puissance 5 cellules par puits, et placez la plaque dans l’incubateur jusqu’à ce que les cellules deviennent adhérentes. Ensuite, mélangez la solution mère de Fura-2/AM et de Pluronic F-127 avec le tampon de Hank contenant 1,3 millimolaire d’ions calcium.

À l’aide d’une feuille d’aluminium, couvrez la solution de travail Fura-2/AM pour la protéger de la lumière. Pour le prétraitement des cellules, transférez les lames de verre avec les cellules dans une nouvelle plaque à 24 puits contenant le tampon de Hank. À l’aide d’une pipette, jetez le tampon de chaque puits et ajoutez 500 microlitres de tampon de travail Fura-2/AM dans chaque puits.

Incuber la plaque à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes pour permettre le chargement de la sonde. Retirez ensuite le tampon de travail Fura-2/AM de chaque puits et lavez les cellules trois fois avec le tampon de Hank pour éliminer l’excès de Fura-2/AM. Pour commencer, procurez-vous les cellules prétraitées pour l’imagerie calcique unicellulaire et démarrez tous les composants du microscope à fluorescence.

Ouvrez le logiciel d’imagerie de fluorescence à partir des options disponibles. Sélectionnez le protocole requis et cliquez sur OK. Ensuite, choisissez Nouvelle expérience dans le menu principal pour lancer une nouvelle configuration expérimentale.

Maintenant, montez la chambre de perfusion sur la platine du microscope et placez soigneusement les lames de cellules traitées à Fura-2/AM dans la chambre contenant la solution tampon de Hank. Ajustez la mise au point sous la lumière blanche pour une visualisation optimale. Sélectionnez Focus dans le panneau de configuration de l’expérience.

Choisissez la longueur d’onde souhaitée pour la mise au point, par exemple 380 nanomètres, et cliquez sur Démarrer la mise au point pour lancer les ajustements focaux. Ajustez la mise au point sur les cellules à l’aide de la mise au point approximative pour rapprocher l’objectif, puis de la recherche de la mise au point pour des ajustements précis. Observez l’expression de la protéine cible par les longueurs d’onde de FITC ou TRITC.

Cliquez ensuite sur Arrêter la mise au point et fermez le panneau de mise au point. Cliquez sur Configurer l’expérience dans la barre des tâches et sélectionnez les étages souhaités pour l’imagerie dans les paramètres de configuration. Cliquez maintenant sur le bouton Région dans la barre de menu pour définir les zones d’imagerie et choisir le type d’éclairage souhaité pour l’imagerie.

Cliquez sur Acquérir des images, puis appuyez sur OK pour capturer des images. Identifier les cellules souhaitées exprimant la protéine cible sous fluorescence, en tenant compte de la lecture à blanc avec les contrôles sous 380 nanomètres. Pour annuler une région sélectionnée, faites un clic droit sur le cercle et sélectionnez Supprimer la région.

Ouvrez le menu Références, cochez la case Soustraire des références, puis cliquez sur OK pour appliquer la soustraction d’arrière-plan. Dans le panneau de configuration de l’expérience, cliquez sur Enregistrer les données de l’expérience. Dans la section Time Lapse du panneau de configuration, réglez l’intervalle d’acquisition de données sur une seconde.

Cliquez ensuite sur Zero Clock et Acquire dans le panneau de configuration de l’expérience pour commencer l’acquisition des données. Appliquez maintenant des traitements sur les cellules selon les exigences. Une fois l’acquisition des données terminée, cliquez sur Pause pour arrêter le processus.

Enregistrez les données acquises et procédez à l’analyse. Pour mettre fin à l’expérience, cliquez sur Fichier et sélectionnez Fermer l’expérience. Enfin, fermez le logiciel et transférez toutes les données enregistrées depuis l’ordinateur.

Les kératinocytes primaires chargés avec la sonde Fura-2 présentaient une morphologie cellulaire visible à une longueur d’onde de 380 nanomètres. La réponse thermique des kératinocytes a montré une augmentation de la concentration d’ions calcium intracellulaires pendant le chauffage, avec une réponse similaire observée pendant le refroidissement. La réponse thermique a été abolie dans les kératinocytes, sans le gène STIM1 indiquant le rôle du gène dans la signalisation thermique du calcium.

HEK293T cellules exprimant trop STIM1/Orai1 ont montré une réponse thermique notable lors du refroidissement, confirmant l’expression génique réussie, comme en témoignent les marqueurs de fluorescence verts et rouges. La réponse d’entrée du calcium opérée par le magasin dans les cellules surexprimant STIM1-Orai1 a été efficacement induite par des changements séquentiels de la concentration de calcium extracellulaire et de l’édition de l’acide cyclopiazonique par profusion. Le pipetage direct de la capsaïcine, un agoniste du TRPV1, a déclenché un afflux de calcium extracellulaire dans les cellules exprimant le plasmide du TRPV1.