Enregistrement des courants K⁺ rectificatifs vers l’intérieur dans des cellules musculaires lisses de l’artère basilaire fraîchement isolées par la technique du patch clamp

Mes recherches portent principalement sur l’électrophysiologie cardio-cérébrovasculaire. Cette étude décrit une méthode permettant d’isoler les cellules musculaires vasculaires primaires et d’utiliser la technologie de pince à cellules entières pour améliorer leurs propriétés électrophysiologiques. L’isolement de cellules fraîches présente des limites telles que l’impact de la température sur la séparation des enzymes, des temps de digestion variables pour différents vaisseaux sanguins et une capacité instantanée dans l’environnement natif des cellules.

De plus, la technologie des pinces à pince présente des défis en matière de rupture de plafond et de membrane, ce qui nécessite une utilisation qualifiée. Ce protocole facilite la recherche consiste à acquérir facilement des cellules primaires actives à partir d’artères manuelles et doit rapidement sonner l’application de la technique de pince à pincer. Pour commencer, remplissez une boîte de Pétri avec une solution saline physiologique froide saturée de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone.

Placez un cerveau de rat isolé dans la boîte de Pétri. Positionnez le cerveau ventralement vers le haut dans la boîte de Pétri et fixez-le avec des aiguilles. Au microscope optique, localisez l’artère basilaire.

À l’aide d’un autoclave, d’une pince à épiler et de ciseaux, retirez soigneusement les tissus environnants. Ensuite, insérez un fil de deux centimètres de long et d’un diamètre de 25 micromètres dans l’artère basilaire isolée. Frottez doucement la paroi interne de l’artère avec le fil pour éliminer efficacement l’endothélium vasculaire.

Pour isoler les cellules musculaires lisses, préchauffez d’abord les solutions dans des tubes à essai un à trois. Transférez l’artère basilaire isolée dans le tube à essai deux. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes tout en injectant continuellement un mélange de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone dans le tube.

Ensuite, transférez l’artère basilaire du tube à essai deux au tube à essai trois et incuber. Transférez un millilitre de solution de séparation cellulaire préchauffée du tube à essai un dans le tube à essai trois. Continuez à injecter 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone tout en maintenant le traitement enzymatique pendant trois minutes.

Triturer la préparation de l’artère basilaire pour libérer les cellules. Ensuite, pipetez quatre millilitres de solution de séparation à froid jusqu’au tube à essai trois pour terminer le processus enzymatique. Centrifuger le mélange à 59 G pendant six minutes.

À l’aide d’une pipette, jeter le surnageant. Ajoutez ensuite à nouveau la solution de séparation à froid. Après le dernier lavage, retirez le surnageant.

Laissez un millilitre de suspension cellulaire. Conservez la suspension cellulaire à quatre degrés Celsius pendant six à huit heures. Transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans un bain.

Ajoutez un millilitre de liquide extracellulaire dans le bain et laissez-le reposer. Pour commencer, allumez une micropipette polaire. Placez un tube de verre dans la polaire.

Sur le panneau de configuration, sélectionnez le premier programme. Cliquez sur Entrée et accédez au premier programme. Effectuez maintenant un test de rampe en cliquant sur rampe sur le panneau de commande pour mesurer la valeur thermique du tube de verre.

Insérez un nouveau tube en verre. Sélectionnez ensuite le premier programme et cliquez sur Entrée pour fabriquer la micro-pipette. Pour enregistrer le courant des soins, lancez d’abord le logiciel d’acquisition de données.

Sélectionnez fichier, puis cliquez sur définir les noms des fichiers de données pour établir un chemin de stockage de données. Activez la fonction de test de membrane dans le menu Outils. Placez un échantillon de cellules musculaires lisses isolées de l’artère basilaire d’un rat au centre de la vue de la caméra d’un microscope.

Plongez l’embout du fil de référence dans la solution du bain. Remplissez ensuite 20 % de la micropipette fabriquée avec la solution intracellulaire. Fixez la micropipette chargée sur le porte-électrode d’enregistrement.

Maintenant, avec une seringue, appliquez une pression positive. Déplacez la pointe de la pipette dans la solution du bain et ajustez le décalage de la pipette sur le logiciel de l’amplificateur de signal pour régler la ligne de base actuelle à zéro picoampère. Appuyez doucement la pipette contre la membrane cellulaire.

Observez une augmentation de la résistance du joint à au moins un magome. Retirez la pression positive et appliquez une pression négative. Pour établir une résistance élevée, avec une résistance d’étanchéité d’au moins un giggome, réglez la tension de maintien à moins 60 millivolts et compensez la capacité de l’électrode à l’aide de CP FAST et CP slow.

Appliquez une brève pression négative pour rompre la membrane cellulaire, formant une configuration cellulaire entière. Sélectionnez la cellule entière dans le logiciel de l’amplificateur de signal. Cliquez ensuite sur auto pour la compensation de la capacité de la membrane.

Chargez le protocole kir et commencez l’enregistrement des données. Des cellules musculaires lisses fraîchement isolées avec une morphologie fusiforme ont été isolées. Les cellules étaient saines et adaptées aux expériences de patch clamp.

Un courant de durcissement typique présentait un redressement vers l’intérieur à des tensions négatives avec un flux de courant d’ions potassium minimal ou nul à des tensions positives. Le chlorure de baryum à des concentrations de 100 à 300 micromoles par litre a inhibé efficacement l’activité du canal kir, confirmant que le courant était kir. Le nitroprussiate de sodium a augmenté le courant kir, indiquant le rôle des canaux kir dans la vasodilatation induite par le SNP.

La comparaison des relations courant-tension a montré une diminution de la densité de courant en présence de chlorure de baryum et une augmentation avec le SNP.