Isolement des micro-organismes du sol à l’aide de la technologie iChip

Nous tentons de découvrir de nouveaux types de chimie pour lutter contre les agents pathogènes agricoles. À l’aide de la technologie iChip, nous avons isolé de nouveaux organismes qui, nous l’espérons, mèneront à une nouvelle chimie. L’analyse de ces organismes et/ou de leurs produits naturels contre les agents pathogènes agricoles pourrait conduire à la découverte de nouveaux organismes et/ou composés candidats aux biopesticides.

La méthode iChip permet d’isoler des micro-organismes inculturables dans des conditions conventionnelles en leur offrant une période de domestication et de contact avec leur milieu naturel. Notre version modifiée de l’iChip est simple, peu coûteuse et réduit le risque de contamination microbienne, ce qui la rend facilement accessible pour une variété d’objectifs de recherche. Les résultats de notre iChip soulèvent des questions telles que : quels mécanismes entraînent la suppression des agents pathogènes par de nouveaux microbes ?

Ces composés bioactifs peuvent-ils fonctionner de manière fiable dans des essais en conditions réelles ? Comment les facteurs environnementaux influencent-ils leur efficacité ? Répondre à ces questions guidera le développement durable de biopesticides, la transformation de la gestion des maladies des plantes et la réduction de la dépendance aux fongicides synthétiques.

Le laboratoire appliquera la technologie iChip pour isoler de nouvelles bactéries à partir de sols suppresseurs de maladies produits par les cultures de couverture, en identifiant de nouveaux microbes et composés bioactifs. Ceux-ci seront testés dans le cadre d’études contrôlées sur les maladies des plantes afin de développer des alternatives innovantes et durables aux fongicides synthétiques pour lutter contre les maladies agricoles. Pour construire une iChip modifiée à l’aide d’un outil de poinçonnage de gélose de 5 millimètres, retirez le fond des puits d’une plaque de 96 puits.

Découpez des membranes en polycarbonate de 0,05 micromètre en rectangles, en vous assurant que les dimensions correspondent à la zone inférieure d’une plaque de 96 puits. Appliquez un mastic silicone pour faire adhérer la membrane de polycarbonate au fond de la plaque de 96 puits. Assurez-vous que l’adhésif scelle les puits, mais ne recouvre pas entièrement les ouvertures des puits.

Laissez sécher les plaques pendant 24 heures. Ajoutez 4,5 millilitres d’eau stérile à chacun des tubes à centrifuger de 15 millilitres étiquetés A à D, et à chacun des tubes de 50 millilitres étiquetés E à H.Ajoutez 1 gramme de sol dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 10 millilitres d’eau dans le tube et faites tourbillonner le mélange pendant 10 minutes.

Laissez la suspension du sol se décanter pendant 10 minutes. Ensuite, pipetez 0,5 millilitre du surnageant de sol dans le tube A et mélangez soigneusement. Maintenant, transférez 0,5 millilitre de suspension cellulaire du tube A au tube B et mélangez soigneusement.

Répétez l’opération pour tous les tubes de centrifugation restants, en complétant une série de dilutions décuplées sur les huit tubes. Pour commencer, immergez complètement les iChips dans de l’éthanol à 95 %. Après 15 minutes, retirez les plaques de l’éthanol et placez-les sur une serviette en papier stérile dans la hotte à flux laminaire.

Laissez l’éthanol s’évaporer tout en allumant le stérilisateur à ultraviolets dans la hotte à flux laminaire pendant 15 minutes. Pipetez 360 microlitres de sels minimaux de succinate stérile ou de milieu SMS dans la première colonne de la plaque pour servir de contrôle. Ajoutez 45 millilitres de SMS à la suspension cellulaire dans le tube E.Mélangez soigneusement pour combiner la suspension cellulaire avec la gélose.

Pipetez 360 microlitres du mélange de cellules gélosées dans tous les puits restants de la plaque de 96 puits. Une fois le support pris, scellez le haut de la plaque avec un couvercle de plaque PCR. Remplissez les plaques à l’aide des tubes F, G et H pour préparer un total de quatre plaques avec des différences de concentrations dix fois plus grandes.

Placez les plaques dans un récipient contenant environ 1 pouce de terre avec le côté de la membrane vers le bas. Incuber les assiettes à l’intérieur du récipient couvert dans l’obscurité à 25 degrés Celsius. Après six semaines, examinez les iChips pour détecter la croissance microbienne.

Rincez l’iChip modifié trois fois avec de l’eau stérile pour éliminer toutes les particules de saleté. Essuyez le haut et les côtés de la plaque avec de l’éthanol à 95 %, en évitant le côté avec la membrane semi-perméable. À l’aide d’une lame stérile, coupez le couvercle de la plaque autour d’un puits contenant une colonie et retirez le carré à l’aide d’une pince à épiler stérile.

À l’aide d’un outil de stries stériles, percez la colonie et tracez des traînées sur la plaque de gélose SMS avec la méthode des quatre quadrants. Incuber les plaques à 25 degrés Celsius pendant une semaine ou jusqu’à ce que la croissance de la colonie soit observée. Après l’incubation, examinez les colonies pour confirmer l’isolement des cultures.