Name: Visualisation 3D des péricytes vasculaires rétiniens chez la souris par immunomarquage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Découvrez la visualisation 3D des péricytes vasculaires rétiniens chez la souris par immunomarquage et clairage tissulaire. Cette méthode améliore l'analyse spatiale des cellules contractiles autour des vaisseaux sanguins.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualisation des péricytes rétiniens à l’aide de l’éclaircissement des tissus et du marquage fluorescent

<ol><li>Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cryo-sections%2C+whole-mounts%2C+and+hypotonic+isolated+vasculature+preparations+for+immunohistochemical+visualization+of+microvascular+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes.</a> J Vis Exp. (140), e57733(2018).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> J Vis Exp. (77), e50546(2013).</li>
<li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nat Commun. 8, 15296(2017).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+New+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+receptor-beta+is+differentially+regulated+in+primary+mouse+pericytes+and+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices.</a> Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+hairy+and+glabrous+skin+innervation+in+a+3d+pattern+using+multiple+fluorescent+staining+and+tissue+clearing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches.</a> J Vis Exp. (183), e63807(2022).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> J Vis Exp. (167), e61742(2021).</li>
<li>Batista, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normative+mice+retinal+thickness%3A+16-month+longitudinal+characterization+of+wild-type+mice+and+changes+in+a+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease.</a> Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte-endothelial+interactions+in+the+retinal+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature.</a> Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+delivery+of+an+anti-angiogenic+peptide+inhibits+pathological+retinal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+of+fitc-dextran+is+an+effective+and+economical+method+for+observing+mouse+retinal+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels.</a> Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).</li>
<li>Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+cells+expressing+ng2+and+platelet-derived+growth+factor+receptor-%CE%B2+in+the+fibrotic+scar+formation+after+3-nitropropionic+acid-induced+acute+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury.</a> Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cubic+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> J Vis Exp. (114), e54401(2016).</li>
<li>Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging the retinal vasculature.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+clarity+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Pericyte morphology and function.</a> Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).</li>
<li>Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+mechanics+and+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Pericyte mechanics and mechanobiology.</a> J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+dysfunction+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neurovascular dysfunction in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).</li>
<li>Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+vascular+cognitive+impairment+and+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia.</a> Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-chèvre IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>Protéger de la lumière</td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>souris Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td>SCXK (Jing) 2021-0006</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-PDGFR-&beta ;</td><td>Recherche et Développement</td><td>AF1042</td><td>25 & micro ; g&nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Lycopersicon esculentum (Tomate) lectine, DyLight594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32471</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Scanner panoramique de tranches de tissus</td><td>Olympus</td><td>VS120-S6-W</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop et&nbsp ; Illustration</td><td>Adobe</td><td>CS6</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 Solution</td><td>SunJin Lab</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Plaque à six puits</td><td>Costar</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td> lame de microscope <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>25 mm x 75 mm x 1 mm</td></tr></tbody></table>

visualisation 3d des péricytes vasculaires rétiniens chez la souris par immunomarquage 

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

Du point de vue extérieur de la rétine entière, la transparence tissulaire de la rétine intégrale a été augmentée en utilisant le traitement de clarification tissulaire par rapport à celle de la rétine sans nettoyage tissulaire (Figure 1).
Pour l’examen histologique de la rétine entière, le système vasculaire rétinien a été marqué en rouge avec de la lectine de tomate fluorescente par injection rétro-orbitaire, et les péricytes rétiniens sont représentés en vert avec PDGFR-β (Figure 2, Figure 3 et Figure 4). Bien que ce marquage ait pu être observé sur l’échantillon avant et après le nettoyage des tissus, à titre de comparaison, le bruit de fond de l’échantillon rétinien a été réduit par le traitement de nettoyage des tissus (Figure 2). Le traitement a également rendu les péricytes rétiniens et le système vasculaire marqués plus clairs sous le scanner panoramique de coupes de tissus (Figure 2) et le microscope confocal à balayage laser (Figure 3).
La distribution graduelle des péricytes rétiniens est également mise en évidence ici le long de l’arbre vasculaire rétinien (Figure 3). De la partie centrale de la rétine à sa région périphérique, les péricytes sont situés sur la membrane basale du système vasculaire rétinien, y compris le tronc vasculaire et les branches et les capillaires (Figure 3).
Sur la base de l’observation ci-dessus, la corrélation spatiale des péricytes et de la vascularisation rétinienne a été évaluée davantage à l’aide des images de la pile Z plus amplifiées de l’échantillon rétinien dégagé (Figure 4). À l’aide du système de traitement d’image, nous avons fourni les vues 3D pour démontrer que les péricytes étaient étroitement enroulés autour du système vasculaire rétinien de différents diamètres (Figure 4). La figure 4A0-D0 représente la ramification hiérarchique des vaisseaux rétiniens du plus haut au plus bas. Comme les péricytes sont plus abondamment répartis dans les capillaires, la coloration PDGFRβ de la figure 4D0 montre une intensité et un signal plus forts par rapport à la figure 4A0-C0.
Contrairement à la rétine de souris sans traitement de nettoyage des tissus (Figure 1A, Figure 2A, Figure 3A0-D0), la présente approche a efficacement réduit les signaux de fond rétiniens pour démontrer la relation spatiale entre les péricytes et les vaisseaux sanguins de la rétine entière (Figure 1B, Figure 2B, Figure 3A1-D1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig01.jpg"> 
Figure 1 : Comparaison de la transparence optique de l’ensemble de la monture de la rétine sans et avec le traitement de nettoyage des tissus. (A, B) Les vues extérieures de l’ensemble de la monture de la rétine avant (A) et après (B) le traitement de nettoyage des tissus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig02.jpg"> 
Figure 2 : Comparaison des caractéristiques de marquage des péricytes rétiniens et de la vascularisation de l’ensemble de la rétine montable sans et avec traitement de nettoyage tissulaire. (A, B) Des vues représentatives du montage de l’ensemble de la rétine monture avant (A) et après (B) le traitement de nettoyage tissulaire ont été prises dans le cadre du système de lames virtuelles. Le système vasculaire est en rouge (lectine fluorescente de la tomate), les péricytes sont en vert (PDGFR-β) et le noyau cellulaire est en bleu (DAPI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig03.jpg"> 
Figure 3 : Comparaison de la résolution d’imagerie des péricytes rétiniens de manière graduelle le long de l’arbre vasculaire rétinien avant et après le traitement de nettoyage des tissus. (A-D) Les images représentatives de la rétine marquée avant le traitement de nettoyage des tissus (A0-D0) et après le traitement de nettoyage des tissus (A1-D1) montrent la distribution des péricytes entourant le système vasculaire rétinien dans l’ordre du tronc vasculaire (A0, A1), les branches du premier ordre (B0, B1), les branches du second ordre (C0, C1) et le capillaire (D0, D1). Le système vasculaire est en rouge (lectine fluorescente de la tomate), les péricytes sont en vert (PDGFR-β) et le noyau cellulaire est en bleu (DAPI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig04.jpg"> 
Figure 4 : Corrélation spatiale des péricytes avec le système vasculaire rétinien de différents diamètres. (A-D) Images représentatives à haute résolution de la rétine marquée le long de l’arbre vasculaire rétinien montrant la distribution des péricytes entourant le système vasculaire rétinien dans différents diamètres, y compris le tronc vasculaire (A0, A1), les branches du premier ordre (B0, B1), les branches du deuxième ordre (C0, C1) et le capillaire (D0, D1). A1-D1 : Les images correspondantes des panneaux A0-D0 ont été reconstruites pour montrer la corrélation spatiale des péricytes avec le système vasculaire rétinien de différents diamètres dans les vues tridimensionnelles et démontrer davantage les vues agrandies des régions locales dans les panneaux A1-D1 (flèches) avec des inserts. Le système vasculaire est en rouge (lectine fluorescente de la tomate), les péricytes sont en vert (PDGFR-β) et le noyau cellulaire est en bleu (DAPI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Visualisation 3D des péricytes vasculaires rétiniens chez la souris par immunomarquage 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

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Découvrez la visualisation 3D des péricytes vasculaires rétiniens chez la souris par immunomarquage et clairage tissulaire. Cette méthode améliore l'analyse spatiale des cellules contractiles autour des vaisseaux sanguins.

Visualisation 3D des péricytes vasculaires rétiniens chez la souris par immunomarquage

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