Visualisation 3D des péricytes vasculaires rétiniens chez la souris par immunomarquage

L’objectif de cette recherche est d’étudier la morphologie et la distribution spatiale des parasites dans le système vasculaire rétinien à l’aide de techniques d’imagerie avancées. Afin de fournir une vue détaillée pour démontrer les caractéristiques morphologiques des parasites, l’étude a décrit une nouvelle approche combinant l’injection rétroorbitaire d’agent fluorescent, la coloration immunofluorescente et le traitement de clarification tissulaire pour faire avancer la recherche dans notre domaine.

Par rapport à l’état de pré-nettoyage du tissu rétinien de souris, les signaux de fond des vaisseaux sanguins et des parasites marqués avec de la lactine de tomate fluorescente et du PDGFR-bêta sont significativement réduits après le nettoyage des tissus, ce qui facilite une observation plus précise de leur relation spatiale.

Nos résultats indiquent que ces techniques sont hautement compatibles pour mettre en évidence les parasites dans le système vasculaire rétinien dans l’ensemble de la rétine. La combinaison de ces techniques histologiques est une approche efficace pour visualiser en détail les caractéristiques morphologiques des parasites à partir d’une vue tridimensionnelle.

[Instructeur] Pour commencer, placez la souris anesthésiée dans la position latérale droite avec sa tête tournée vers la gauche. Appuyez doucement deux doigts sur la zone périorbitaire pour exposer l’œil gauche de la souris. À l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 27, percez doucement environ deux à trois millimètres dans le sinus veineux orbitaire, en vous assurant que le biseau de l’aiguille est tourné vers l’avant à un angle de 45 degrés. Injectez 0,1 millilitre de lactine de tomate fluorescente dans le sinus veineux orbitaire. Après cinq minutes d’injection rétroorbitaire, euthanasiez la souris et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la cavité thoracique. Insérez une aiguille de calibre 24 de deux millimètres dans le ventricule cardiaque gauche par l’apex ventriculaire gauche. Effectuez une perfusion à un rythme de trois millilitres par minute avec 20 millilitres de solution saline physiologique à 0,9 %, suivis de 20 millilitres de solution saline physiologique à 4 %. Injecter 0,1 millilitre de formaldéhyde à 0,9 % dans un tampon de phosphate à 0,1 molaire. Ensuite, placez la souris sacrifiée sur le côté et retirez la peau recouvrant les yeux avec des ciseaux. Énucléez les yeux avec des ciseaux et des pinces. Coupez le nerf optique et les tissus environnants et soulevez l’œil. Transférez l’œil sur une plaque à 12 puits pour le fixer dans du formaldéhyde à 4 % dans un tampon de phosphate à 0,1 molaire pendant deux heures. Après fixation, cryoprotégez l’œil dans 25 % de saccharose dans un tampon de phosphate 0,1 molaire à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il coule au fond de la solution. À l’aide d’une pipette pasteure en plastique, transférez l’œil dans une boîte de Pétri contenant un tampon de phosphate de 0,1 molaire. Percez le bord de la cornée avec des ciseaux bien aiguisés, coupez autour de la cornée et de l’iris et jetez-les. À l’aide d’une pince, retirez le cristallin et l’humeur vitrée. Ensuite, à l’aide d’une pince fine, retirez la rétine en forme de coupe du centre de l’œil. Rincez la rétine avec un tampon de phosphate de 0,1 molaire dans une boîte de Pétri propre. Après avoir isolé la rétine de souris en forme de coupe, incubez-la dans un incubateur de 20 heures avec une solution de Triton X-100 à 2 % dans un tampon de phosphate à 0,1 molaire pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez la rétine dans la solution bloquante et tournez à 72 tr/min sur le shaker pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, placez la rétine dans un tube de microcentrifugation contenant les anticorps primaires de la chèvre anti-PDGFR bêta dans un tampon de dilution. Faites pivoter le tube sur l’agitateur pendant deux jours à quatre degrés Celsius. Après deux jours, lavez la rétine deux fois avec un tampon de lavage à température ambiante. Placez la rétine dans le tampon de lavage et transférez-la dans le shaker pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez la rétine dans un tube de microcentrifugation contenant une solution d’un milligramme par millilitre d’anticorps secondaire d’âne anti-chèvre 488 et de 0,2 nanogramme par millilitre de coloration nucléaire fluorescente DAPI. Faites pivoter le tube sur l’agitateur à 72 tr/min pendant cinq heures à quatre degrés Celsius. Lavez la rétine dans une plaque à six puits avec un tampon de lavage pendant une heure deux fois à température ambiante. Incuber la rétine dans un tampon de lavage sur le shaker pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez la rétine dans le réactif de clarification des tissus et faites-la pivoter doucement sur le shaker à 60 tr/min pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après le nettoyage des tissus, rincez la rétine avec un tampon de phosphate de 0,1 molaire dans une boîte de Pétri propre. À l’aide de ciseaux à ressort, faites quatre incisions radiales atteignant environ 2/3 du rayon de la rétine pour créer une forme de pétale. Aplatissez la rétine et montez-la sur une lame de microscope avec l’intérieur de la rétine vers le haut. Utilisez un petit morceau de papier absorbant pour enlever tout excès de tampon de phosphate. Encerclez la rétine montée à l’aide d’une entretoise. Remplissez l’espace avec un réactif de clarification des tissus frais et placez une lamelle de couverture sur le dessus. Numérisez les vues de montage de la rétine étiquetée à l’aide du scanner panoramique de coupes de tissus. Prenez les images à fort grossissement à l’aide d’un système d’imagerie équipé d’un objectif 2X et d’un objectif 10X avec des ouvertures numériques de 0,40 et 0,95, respectivement. Capturez des images empilées 50Z de la rétine étiquetée dans deux cadres micrométriques. Cliquez séquentiellement sur Définir le plan focal de début, Définir le plan focal de fin, Définir la taille du pas, choisissez Motif de profondeur, Capture d’image et Série Z pour intégrer toutes les images en une seule image nette à l’aide du mode de projection et de topographie. Ensuite, capturez des images en utilisant la fluorescence verte à 499 et 519 nanomètres, la fluorescence rouge à 591 et 618 nanomètres et la fluorescence bleue à 401 et 421 nanomètres. Sélectionnez séquentiellement Ajouter de nouvelles surfaces, choisissez Paramètres de volume, Choisissez Canal source, ajustez l’affichage, ajustez l’angle de surface et Instantané pour importer les images confocales Z-Stack dans le logiciel d’analyse et reconstruire les images dans le motif tridimensionnel. La transparence tissulaire de l’ensemble de la rétine a été augmentée après le traitement de clarification tissulaire par rapport à la rétine sans clarification tissulaire. Le système vasculaire rétinien marqué à la lectine de tomate et les parasites rétiniens marqués au PDGFR-β étaient visibles avant et après le nettoyage des tissus, mais le bruit de fond a été réduit après le nettoyage des tissus. Des parasites rétiniens ont été observés le long de l’arbre vasculaire, montrant une distribution graduelle des régions centrales vers les régions périphériques de la rétine. Les images tridimensionnelles Z-Stack de la rétine dégagée ont montré des parasites étroitement enroulés autour des vaisseaux rétiniens de différents diamètres avec une coloration plus forte β PDGFR- dans les capillaires.