Name: Isolement enzymatique des vésicules extracellulaires interstitielles du muscle squelettique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez l'isolement enzymatique des vésicules extracellulaires interstitielles du muscle squelettique chez le rongeur. Cette méthode standardisée permet d'obtenir des vésicules de haute pureté pour étudier l'homéostasie musculaire et les biomarqueurs diagnostiques.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolement optimisé des VE dérivés des muscles squelettiques pour la recherche et la thérapeutique

<ol><li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+ultrasound+promotes+secretion+of+anti-inflammatory+extracellular+vesicles+from+skeletal+myotubes+via+elevation+of+intracellular+calcium+level%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level.</a> Elife. 12, 89512(2023).</li>
<li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myotube-derived+extracellular+vesicles+enhance+itaconate+production+and+attenuate+inflammatory+responses+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages.</a> Front Immunol. 14, 1099799(2023).</li>
<li>Takada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+blunts+the+osteogenic+effects+of+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles+by+affecting+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells.</a> Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).</li>
<li>Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+adipocyte+and+myotube+extracellular+vesicle+miRNA+cargo+in+chronic+binge+alcohol-administered+siv-infected+male+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques.</a> Alcohol. 108, 1-9 (2023).</li>
<li>Kargl, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+potential+of+skeletal+muscle+derived+extracellular+vesicles+differs+between+oxidative+and+glycolytic+muscle+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice.</a> Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).</li>
<li>Vann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+microRNA+profiles+of+intramuscular+and+secreted+extracellular+vesicles+in+human+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle.</a> Front Physiol. 13, 937899(2022).</li>
<li>Anakor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+vesicles+secreted+by+als+patient+myotubes+is+specific+to+exosome-like+and+not+larger+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes.</a> Cells. 11 (5), 845(2022).</li>
<li>Mendhe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+increase+muscle+reperfusion+but+degrade+muscle+structural+proteins+in+a+mouse+model+of+hindlimb+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury.</a> Cells. 12 (4), 557(2023).</li>
<li>Madison, R. D., Robinson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+extracellular+vesicles+influence+motor+neuron+regeneration+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy.</a> Neuroscience. 419, 46-59 (2019).</li>
<li>Hanson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-mediated+promotion+of+myogenic+differentiation+is+dependent+on+dose%2C+collection+medium%2C+and+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).</li>
<li>Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+stem+cell+populations+from+individual+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles.</a> J Vis Exp. 190, e64557(2022).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28misev2018%29%3A+A+position+statement+of+the+international+society+for+extracellular+vesicles+and+update+of+the+misev2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+argues+against+a+general+role+for+CD9%2C+CD81+or+CD63+in+the+sorting+of+proteins+into+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).</li>
<li>Baietti, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-syntenin-Alix+regulates+the+biogenesis+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes.</a> Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).</li>
<li>Shanely, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+biopsy+procedures+using+the+modified+bergstr%C3%B6m+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique.</a> J Vis Exp. (91), e51812(2014).</li>
<li>Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+enhance+the+survival+of+muscle+fibers+in+edl%2C+but+not+sol%2C+after+neonatal+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advantage+of+recombinant+collagenase+for+isolation+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells.</a> Regen Ther. 7, 1-7 (2017).</li>
<li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> J Vis Exp. (86), e50846(2014).</li>
<li>Mozzetta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of muscle stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).</li>
<li>Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+disrupts+extracellular+vesicle-mediated+signaling+in+regenerating+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers.</a> Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+extracellular+vesicles+transport+glycolytic+enzymes+to+mediate+muscle-to-bone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk.</a> Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microtubes à centrifuger de 0,6 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Microtube de 1,5 mL (C)&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5720411009</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL microtubes à centrifuger</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3448</td><td>Transparent, gradué, non stérile</td></tr><tr><td>BD 5 mL Seringue</td><td>Becton Dickinson</td><td>14-827-52&nbsp ;</td><td>Pointe Luer-Lok</td></tr><tr><td>Lames de comptage de cellules, double chambre pour compteur de cellules</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>22620667</td><td></td></tr><tr><td>Solution de nettoyage</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagénase II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) Liquide (-calcium,-magnésium)</td><td>Cytiva</td><td>SH30378.02</td> La <td>dilution finale utilisée est de 1x</td></tr><tr><td>DPBS/Modified (1x)</td><td>Cytiva</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>E-POD Pure Distributeur d’eau à distance</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZRXSP0D01</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-30-11 Microcentrifugeuse Rotor</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-503</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyzer Flow</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heratherm OGS60 Four à protocole général</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51028112</td><td>Convection par gravité, 2,3 pi³ 120 V</td></tr><tr><td>MemGlow-488 Sonde</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>MG01-02</td><td></td></tr><tr><td>Millipak Special Millipore Millipore</td><td>Millipore Sigma</td><td>TANKMPK02</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette ER LTS 1000&micro ; L F 768G/8</td><td>Rainin</td><td>30808038</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette ER LTS 20&micro ; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette ER LTS 200&micro ; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807967</td><td></td></tr><tr><td>Perles de contrôle de la qualité</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S110-AT Rotor à angle fixe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45539</td><td>1,10,000 tr/min</td></tr><tr><td>S16 exo 65-155nm</td><td>billes NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>SPI, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall mX 150+ Micro-Ultracentrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50135641</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 compteur de cellules automatisé</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>SPI, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 15mL tubes à centrifuger</td><td>Avantor</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 13 Filtres</td><td>Cytiva</td><td>6782-1304</td><td>0.45 &micro ; m taille des pores</td></tr><tr><td>Souris sauvages C57BL/6J</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>stock #000664</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement enzymatique des vésicules extracellulaires interstitielles du muscle squelettique

Enzymatic Isolation of Skeletal Muscle Interstitial Extracellular Vesicles

À la suite de ce protocole, des vésicules extracellulaires musculaires squelettiques (SkM-EV) ont été extraites avec succès de divers groupes musculaires, notamment le tibial antérieur (TA), le long extenseur des doigts (EDL), le soléaire (SOL), le gastrocnémien (GAS) et le quadriceps (QUA) de souris de type sauvage. La caractérisation ultérieure de ces SkM-EV a été réalisée par cytométrie en nanoflux, élucidant leurs caractéristiques distinctes telles que résumées dans le tableau 1. Remarquablement, à p...

Isolement enzymatique des vésicules extracellulaires interstitielles du muscle squelettique

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-enclosed nanoparticles released by cells to transport bioactive cargo, such as proteins, RNAs, and DNAs, ...

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Isolement et culture des fibres musculaires est...

Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Les vaisseaux sanguins à l'intérieur du squelette port musculaire plusieurs populations de précurseurs multi-lignée humaine qui sont idéales pour les applications de régénération. Cette méthode permet l'isolement de purification simultanée de trois populations de cellules précurseurs pluripotentes respectivement à partir de trois couches de structure des vaisseaux sanguins: les cellules myogéniques endotheliales de l'intima, média de péricytes et les cellules de l'adventice de l'adventice.

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Les principaux types de cellules adhérentes dérivées du muscle humain sont les cellules myogéniques et les fibroblastes. Ici, les populations cellulaires sont enrichies à l’aide d’un tri cellulaire activé par magnétisme basé sur l’antigène CD56. L’immunomarquage ultérieur avec des anticorps spécifiques et l’utilisation de techniques d’analyse d’images permettent de quantifier les caractéristiques cytoplasmiques et nucléaires dans les cellules individuelles.

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’isoler les petites vésicules extracellulaires (EVs) de tissus entiers, y compris des échantillons de cerveau et la tumeur. Cette méthode offre une technique reproductible pour extraire les EVs de tissu plein pour approfondir les analyses en aval.

Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Ce protocole illustre 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir du muscle gastrocnémien de souris adulte ainsi que 2) la purification et la caractérisation des exosomes à l’aide d’une méthode d’ultracentrifugation différentielle combinée à des gradients de densité de saccharose suivis d’analyses par western blot.

Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques

Nous décrivons ici l’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées du tissu cancéreux du foie grâce à une méthode d’ultracentrifugation différentielle optimisée.

Procédé d’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées de tissus cancéreux du foie

Ce protocole décrit l’isolement des cellules souches musculaires et des progéniteurs fibro-adipogènes des muscles squelettiques individuels chez la souris. Le protocole implique la dissection musculaire unique, l’isolement des cellules souches par tri cellulaire activé par fluorescence, l’évaluation de la pureté par coloration par immunofluorescence et la mesure quantitative de l’entrée en phase S par test d’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine.

Isolement de populations de cellules souches quiescentes à partir de muscles squelettiques individuels

Ce protocole fournit une méthode standardisée pour isoler et enrichir les myoblastes primaires du muscle squelettique de la souris adulte et néonatale via la dissociation tissulaire, la filtration séquentielle, le préplaque et des conditions de culture définies, permettant l’établissement et le maintien de cultures de myoblast dérivées des cellules satellites pour des applications expérimentales en aval.

Isolement des cellules satellites du muscle squelettique pour les études de myogenèse in vitro

Ce protocole décrit l’isolement des fibres musculaires uniques intactes du solèus oxydatif et l’établissement de cultures de myoblast hautement purifiées dérivées de ces fibres. La procédure optimisée permet de fournir de manière fiable environ 300 à 500 myofibres intactes par souris, permettant des analyses moléculaires et cellulaires en aval.

Essai d’isolation à fibre unique pour l’évaluation du comportement des myofibres oxydatives

Ce protocole décrit l’isolement de petites vésicules extracellulaires à partir du muscle squelettique murin et de la moelle osseuse à l’aide de digestion enzymatique et de chromatographie à exclusion de taille, permettant la récupération reproductible de fractions enrichies en vésicule à partir de tissus structurellement complexes et à faible rendement pour une analyse moléculaire en aval.

Isolation de petites vésicules extracellulaires du muscle squelettique murin et de la moelle osseuse par chromatographie à exclusion de taille

Découvrez l'isolement enzymatique des vésicules extracellulaires interstitielles du muscle squelettique chez le rongeur. Cette méthode standardisée permet d'obtenir des vésicules de haute pureté pour étudier l'homéostasie musculaire et les biomarqueurs diagnostiques.

Isolement enzymatique des vésicules extracellulaires interstitielles du muscle squelettique

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