Mise au point d’un système protoplaste du chou pour l’étude de la tolérance à l’hypoxie chez les brassicacées
20 septembre 2024
Ce protocole décrit un système efficace de protoplastes du mésophylle du chou. Divers traitements déficients en oxygène ont été testés, et le système a montré une forte activation des gènes sensibles à l’hypoxie, facilitant l’étude des mécanismes génétiques et moléculaires de la tolérance aux inondations chez les légumes Brassicaceae .
Nous étudions comment les choux réagissent à un faible taux d’oxygène au niveau moléculaire. Comme les choux sont difficiles à obtenir, nous développons un système utilisant des cellules de chou isolées. En exposant ces cellules de rechange, également appelées protoplastes, à des conditions de faible teneur en oxygène, nous pouvons facilement étudier leur réponse au stress.
Travailler avec du protoplaste en suspension en solution pour étudier les réponses à faible teneur en oxygène est délicat. Le grand défi est de conserver suffisamment d’oxygène pour nos échantillons de contrôle. Nous avons trouvé un moyen de pomper l’oxygène dans le liquide.
Nous avons validé la méthode par des dosages rapporteurs de marqueurs d’hypoxie. Nous avons testé différentes méthodes pour gérer un faible taux d’oxygène et avons constaté que le pack d’absorption d’oxygène fonctionne le mieux. Il est facile à utiliser et efficace, ce qui le rend idéal pour étudier le comportement des protoplastes dans des conditions de faible teneur en oxygène.
L’étude du mécanisme moléculaire dans les cultures feuillues dans des conditions d’hypoxie a été difficile en raison de la limitation des outils disponibles, mais avec les progrès récents, nous avons fait de grands progrès en utilisant un système de protoplaste du chou avec traitement par hypoxie. Cette nouvelle méthode nous aide à comprendre comment un faible taux d’oxygène affecte ces plantes au niveau moléculaire. À l’avenir, nous prévoyons de combiner le système protoplaste avec des tests d’immunoprécipitation et de rapporteur pour illustrer la voie de régulation moléculaire impliquée dans le chou lors du stress d’inondation.
Notre objectif est d’identifier les principaux régulateurs de la tolérance aux inondations, ce qui, nous l’espérons, aidera à créer un nouveau cultivar de chou avec une meilleure tolérance aux inondations. Pour commencer, remplissez les trous ronds de forme carrée d’un plateau de 48 puits avec un substrat végétal commercial et semez Fuyudori et 228 graines de chou à environ un centimètre de profondeur dans le milieu de culture. Pour préparer 12,5 millilitres de solution enzymatique, préchauffez une solution contenant 10 millimolaires de MES et 0,6 molaire de mannitol à 55 degrés Celsius.
Ajouter ensuite 1,5 % de cellulase R-10 et 0,75 % de macérozyme R-10. Remuez la solution et continuez à chauffer à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes. Laissez la solution enzymatique refroidir à température ambiante.
Ajoutez ensuite 10 millimolaires de chlorure de calcium et 0,1 % d’albumine sérique bovine. À l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre, stérilisez la solution enzymatique dans une boîte de Pétri de neuf centimètres. Après deux à trois semaines de croissance, récoltez les plants de chou au stade de la deuxième feuille pour l’isolement des protoplastes du mésophylle.
Récoltez les deuxièmes vraies feuilles nouvellement développées de cinq à huit plants de chou. À l’aide d’une lame de rasoir tranchante, coupez les feuilles en bandes de 0,5 à 1,0 millimètre. Transférez immédiatement les bandes de feuilles dans la solution enzymatique fraîchement préparée.
Soumettez les lamelles de chou à l’infiltration sous vide dans l’obscurité pendant 30 minutes. Après l’infiltration sous vide, maintenez les bandes de feuilles immergées dans la solution enzymatique dans l’obscurité pendant quatre à 16 heures. Le lendemain, diluez la solution contenant les protoplastes avec un volume égal de solution W5 pour arrêter la digestion enzymatique.
Pour libérer la suspension des protoplastes, faites tourner doucement le mélange sur un agitateur orbital. Filtrez ensuite la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger la solution de protoplaste à 150 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.
Ajouter 10 millilitres de solution W5 le long de la paroi du tube à un débit d’environ un millilitre par seconde pour laver les protoplastes granulés. Après la dernière centrifugation, remettre les protoplastes en suspension dans la solution W5 et placer le tube sur de la glace pendant 30 minutes. Retirez ensuite un millilitre de surnageant à la fois jusqu’à ce que tout le surnageant soit éliminé.
Remettre les protoplastes en suspension dans une solution de MMG pré-réfrigérée par de la glace. Mesurez la concentration de protoplastes à l’aide d’un hémocytomètre. Ajustez la concentration finale à 4 fois 10 à la puissance 5 protoplastes par millilitre à l’aide de la solution MMG.
Après l’isolement et la digestion pendant la nuit, le rendement en protoplastes était de 1,04 fois 10 à la puissance 7 pour Fuyudori et de 4,00 fois 10 à la puissance 6 protoplastes par gramme de poids frais pour 228. L’efficacité de transfection des protoplastes était supérieure à 40 % chez Fuyudori et 228 cultivars, comme le démontre le gène rapporteur GFP. Après avoir isolé le protoplaste du chou, mélangez 100 microlitres de 4 fois 10 à la puissance 4 protoplastes avec 10 microlitres de plasmide et placez le mélange sur de la glace pendant 10 minutes.
Ajoutez un volume égal de solution de PEG fraîchement préparée dans la solution de protoplaste et mélangez délicatement. Incuber le mélange de protoplastes à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 440 microlitres de solution W5 pour terminer la réaction.
Centrifuger les protoplastes transfectés à 150 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Remettre la pastille en suspension dans 750 microlitres de solution W5 enrichie en oxygène. Transférez les protoplastes remis en suspension dans une plaque de culture tissulaire à six puits précodée avec 1 % d’albumine sérique bovine.
En cas d’hypoxie induite par un sac de consommation d’oxygène, placez une plaque contenant une solution de protoplaste W5 dans un bocal anaérobie de 3,5 litres. Ajoutez ensuite deux packs d’absorbeurs d’oxygène dans le bocal pour créer un environnement hypoxique. Après le traitement, centrifugez les protoplastes à 150 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez le surnageant et congelez les protoplastes collectés dans de l’azote liquide avant de procéder à un double dosage de la luciférase. L’absorbeur d’oxygène a induit une augmentation de 7,0 fois de l’activité du promoteur BoADH1 par rapport au témoin, démontrant la réponse hypoxique la plus élevée. L’activité du promoteur BoSUS1L a été multipliée par plus de 5,6, le traitement par pack d’absorption d’oxygène montrant la plus grande induction parmi les traitements.
Aperçu
Cette étude examine les réponses moléculaires des protoplastes de chou aux conditions de faible oxygène, qui simulent le stress dû aux inondations. En développant un nouveau système de protoplastes qui améliore l'étude des gènes sensibles à l'hypoxie, la recherche vise à élucider les mécanismes génétiques sous-jacents à la tolérance aux inondations des légumes de la famille des Brassicacées.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Réponses au stress des plantes
- Tolérance aux inondations des légumes
- Mécanismes génétiques et moléculaires
Contexte
- Les choux sont difficiles à se procurer, ce qui nécessite l'utilisation d'un système cellulaire tel que les protoplastes.
- Les recherches sur les réponses des plantes à l'hypoxie sont limitées par les techniques disponibles.
- La compréhension des mécanismes moléculaires peut améliorer les efforts de sélection pour une meilleure tolérance aux inondations.
Méthodes utilisées
- Développement d'un système de protoplastes de chou isolés utilisant une digestion enzymatique.
- Exposition des protoplastes à des conditions contrôlées de faible oxygène pour imiter l'hypoxie.
- Utilisation d'essais rapporteurs pour valider l'activation des gènes sensibles à l'hypoxie.
Résultats principaux
- Établissement réussi d'un système de protoplastes avec une efficacité élevée de transfection.
- Les protoplastes exposés à des traitements absorbant l'oxygène ont montré des augmentations significatives de l'expression des gènes sensibles à l'hypoxie.
- Induction de marqueurs clés de l'hypoxie validée par des essais de double luciférase.
Conclusions
- L'étude met en évidence une méthode efficace pour analyser les réponses moléculaires des choux au faible oxygène.
- Les résultats pourraient faciliter le développement de cultivars de chou avec une tolérance améliorée au stress dû aux inondations.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Flooding-induced hypoxia is a major threat to Brassica crop yields, demanding robust early-stage tools for dissecting stress tolerance mechanisms. The cabbage protoplast system with controlled hypoxia induction enables rapid, quantitative interrogation of gene function in a transformation-recalcitrant species. This platform advances predictive confidence in target validation and accelerates the identification of molecular regulators for breeding resilient cultivars.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of hypoxia-responsive genes in a physiologically relevant plant system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and quantifying promoter activation under defined oxygen conditions.
- Facilitates rapid hypothesis testing for candidate gene roles in stress adaptation pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-yield protoplast isolation and transfection workflow for downstream assays.
- Delivers reproducible, quantitative dual-luciferase readouts for promoter activity under hypoxia.
- Enables scalable screening of genetic constructs or chemical modulators affecting hypoxia response.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with physiological stress responses relevant to crop improvement.
- Supports continuity from gene discovery to trait validation in breeding pipelines.
- Reduces translational risk by modeling stress adaptation in a commercially important species.
Pipeline & Workflow Integration
This protoplast-based system bridges early discovery and pre-breeding, enabling functional genomics, target validation, and quantitative screening in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene function in hypoxia tolerance pathways.
- Screening: Provides validated, reproducible quantitative assays for promoter activation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene activation across treatments and controls.
- Translational Research: Connects molecular responses to phenotypic outcomes relevant for cultivar development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and stress response studies in Brassica.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target gene selection for stress tolerance.
- Operational Value: Standardizes protoplast isolation and hypoxia induction for reproducible results.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for candidate genes in breeding pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets for crop resilience.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell isolation, transfection, and reporter assays.
- Needs access to controlled hypoxia induction equipment and dual-luciferase analytics.
- Demands cross-team standardization of protoplast preparation and assay conditions.
- Adaptation to other Brassica species may require protocol optimization.
- Potential limitations include protoplast viability and scalability for high-throughput studies.
