Name: Mise au point d’un système protoplaste du chou pour l’étude de la tolérance à l’hypoxie chez les brassicacées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez un système de protoplastes de chou pour étudier la tolérance à l'hypoxie chez les brassicacées. Cette méthode permet d'analyser les réponses moléculaires au stress d'inondation et d'améliorer le développement de variétés résistantes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Système efficace de protoplaste du chou pour l’étude des mécanismes de tolérance aux inondations

<ol><li>Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global-scale+river+flood+in+the+last+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Global-scale river flood in the last 50 years.</a> Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).</li>
<li>Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flood+adaptive+traits+and+processes%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Flood adaptive traits and processes: An overview.</a> New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).</li>
<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defense+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protoplast+isolation%2C+transformation%2C+and+its+application+in+sugarcane+%28Saccharum+spontaneum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L).</a> Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).</li>
<li>Adedeji, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protocol+for+efficient+protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+carnation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation.</a> Sci Hortic. 299, 111057(2022).</li>
<li>Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protoplast+transient+expression+system+to+enable+molecular%2C+cellular%2C+and+functional+studies+in+Phalaenopsis+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids.</a> Front Plant Sci. 9, (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+mesophyll+protoplast+isolation+and+PEG-mediated+transient+expression+system+in+eggplant%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant.</a> Sci Hortic. 304, 111303(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protoplast+isolation+system+for+functional+gene+expression+and+characterization+using+petals+of+Camellia+oleifera%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera.</a> Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+isolation+of+Populus+mesophyll+protoplasts+and+its+application+in+transient+expression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays.</a> PLOS One. 7 (9), e44908(2012).</li>
<li>Gottschald, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIAR+and+TIA-1+mRNA-binding+proteins+co-aggregate+under+conditions+of+rapid+oxygen+decline+and+extreme+hypoxia+and+suppress+the+HIF-1%CE%B1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway.</a> J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).</li>
<li>Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).</li>
<li>Boudreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+light+dose+engineering+to+reduce+photo-bleaching+and+photo-toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity.</a> Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplex+imaging+and+optogenetics+of+Rho+GTPases+enabled+by+near-infrared+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET.</a> Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).</li>
<li>Jiang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+sulfite+is+a+potential+hypoxia+inducer+that+mimics+hypoxic+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans.</a> J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).</li>
<li>Lin, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUB1A-1+anchors+a+regulatory+cascade+for+epigenetic+and+transcriptional+controls+of+submergence+tolerance+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+Nexus%22%5BJournal%5D)">SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice.</a> PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-molybdopterin+guanine+dinucleotide+modulates+hemolysin+expression+under+anaerobiosis+and+contributes+to+fitness+in+vivo+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+hypoxia-induced+gene+zmPORB1+determines+tocopherol+content+in+the+maize+kernel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel.</a> Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Acide éthanesulfonique 2-(N-morpholino)</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M825</td><td>Pour la préparation de solutions enzymatiques</td></tr><tr><td>228 graines de chou</td><td>Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td>Pour la préparation de solutions enzymatiques</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 6 puits</td><td>Alpha Plus</td><td>16106</td><td>Pour l’incubation de protoplastes</td></tr><tr><td>70 &mu ; Crépine à cellules m</td><td>Sorfa&nbsp ;</td><td>SCS701</td><td>Pour la filtration des protoplastes</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 9 cm</td><td>Alpha Plus</td><td>16001</td><td>Pour la digestion enzymatique</td></tr><tr><td>Bocal anaérobie</td><td>HIMEDIA</td><td>Bocal anaérobie 3,5 L</td><td>Pour le traitement de l’hypoxie&nbsp ;</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Pour la préparation de la solution W5 et l’enrobage de la plaque</td></tr><tr><td>de culture Chlorure de calcium</td><td>J.T.Baker</td><td>131301</td><td>Pour la préparation de la solution W5 et de la solution PEG</td></tr><tr><td>Cellulase R10</td><td>Yakult</td><td></td><td>Pour la préparation de la solution enzymatique</td></tr><tr><td>Dessiccateur</td><td>Tarsons&nbsp ;</td><td>402030</td><td>Pour l’infiltration sous vide</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td>Pour la préparation de la solution W5</td></tr><tr><td>Compteur d’oxygène dissous</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Star A223</td><td>Pour la mesure de l’oxygène</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td>Pour la préparation de solutions enzymatiques, de solutions PEG et de solutions MMG</td></tr><tr><td>Système de dosage Dual-Luciferase Reporter</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Pour le test de rapporteur à double luciférase</td></tr><tr><td>EC-Oxyrase</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>EC-0005</td><td>Pour le traitement de l’hypoxie</td></tr><tr><td>Graines de chou Fuyudori</td><td>Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse</td><td>Hitachi</td><td>CR21GIII</td><td>Pour la récolte de protoplastes</td></tr><tr><td>Macerozyme R10&nbsp ;</td><td>Yakult</td><td></td><td>Pour la préparation de solutions enzymatiques</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Alfa Aesar</td><td>12315</td><td>Pour la préparation de solutions MMG</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td>Pour la récolte de protoplastes</td></tr><tr><td>Greneuse</td><td>de microplaques</td><td>655075</td><td>Pour le dosage de la double luciférase rapporteure</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>SpectraMax Mini</td><td>Pour Dosage de la double luciférase</td></tr><tr><td>rapporteur Millex 0,22 &mu ; m filtre à seringue</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>Pour la préparation de solutions enzymatiques</td></tr><tr><td>Pompe à vide sans huile</td><td>Rocker&nbsp ;</td><td>Rocker 300</td><td>Pour l’infiltration sous vide</td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td>Pour le traitement de l’hypoxie</td></tr><tr><td>Pack absorbeur d’oxygène</td><td>Mitsubishi Gas Chemical Company</td><td>AnaeroPack, MGCC1</td><td>Pour le traitement de l’hypoxie</td></tr><tr><td>Concentrateur d’oxygène</td><td>ULTIMATE PERFECT</td><td>AII-X</td><td>Pour le bouillonnement de l’oxygène dans la solution W5</td></tr><tr><td>Substrat végétal</td><td>Klasmann-Deilmann</td><td>Substrat Potgrond H</td><td>Pour la préparation des plants de chou</td></tr><tr><td>Kit Midi plasmide</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td>Pour la purification de l’ADN plasmidique de qualité transfection</td></tr><tr><td>Polyéthylène Glycol 4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td>Pour la transfection de protoplastes</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>J.T.Baker</td><td>304001</td><td>Pour la préparation de la solution W5</td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Gillette</td><td></td><td>Pour la préparation des lamelles de chou</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td>Pour la préparation de la solution W5</td></tr><tr><td>Sulfite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td>Pour le traitement de l’hypoxie</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Yihder</td><td>BU-240D</td><td>Pour la préparation d’une solution enzymatique</td></tr></tbody></table>

mise au point d’un système protoplaste du chou pour l’étude de la tolérance à l’hypoxie chez les brassicacées

Development of a Cabbage Protoplast System for Studying Hypoxia Tolerance in Brassica

Ce travail a permis de développer un système d’expression transitoire utilisant des protoplastes de chou (voir la figure 1 pour le flux de travail). Des protoplastes ont été isolés chez des vraies feuilles de chou de 2 à 3 semaines de taille appropriée (figure 2A) chez des cultivars commerciaux de chou 'Fuyudori' et '228' par digestion cellulase/macérozyme et par infiltration sous vide foncé (figures 2B et C). Pour atténuer les conditions hypoxiques rencontrées par les protoplastes immergés pendant l’incubation, la solution W5 a été oxygénée à l’aide d’un barboteur à pierre à air relié à une machine à oxygène (Figure 2D). Ce processus a considérablement augmenté la concentration d’oxygène dissous dans la solution W5 de 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 à 29,18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1 après 5 min de bouillonnement d’oxygène. Après le processus d’isolement, le rendement en protoplastes a été de 1,04 x 107 pour 'Fuyudori' et de 4,00 x 106 protoplastes·g−1 de poids frais pour '228' après une nuit de digestion (figure 2E). Par la suite, la GFP a été utilisée comme gène rapporteur pour évaluer l’efficacité de la transformation de la méthode de transfection médiée par le PEG, démontrant que l’efficacité de la transfection des protoplastes chez le chou était supérieure à 40 % chez les deux cultivars (figure 2F), confirmant ainsi la viabilité de ce système.
De plus, des constructions promotrices des gènes de réponse à la respiration anaérobie du chou, les vecteurs BoADH1p ::Luc et BoSUS1Lp ::Luc (Figure 3A), ont été introduites dans des protoplastes de chou en tant que rapporteurs pour évaluer les effets d’induction hypoxique de plusieurs traitements. Divers traitements d’ajustement de l’oxygène ont également été appliqués à ce système de modèle d’expression transitoire. Les résultats ont montré que tous les traitements de piégeage de l’oxygène, à l’exception du sulfite de sodium, induisaient avec succès une réponse d’hypoxie dans les protoplastes du chou (Figure 3B). Plus précisément, l’activité promotrice de BoADH1 a été multipliée par environ 2,6 et 3,2 par rapport au témoin après un traitement par EC-Oxyrase et OxyFluor, respectivement, et, notamment, par plus de 7,0 fois avec un traitement par pack d’absorbeur d’oxygène (Figure 3B). De même, l’activité du promoteur BoSUS1L a augmenté d’environ 1,7 fois et 1,8 fois avec le traitement EC-Oxyrase et OxyFluor, respectivement, tandis que le traitement par pack d’absorption d’oxygène a induit une augmentation substantielle de plus de 5,6 fois (Figure 3B). Ces résultats suggèrent que l’absorbeur d’oxygène démontre une efficacité supérieure dans la création d’un environnement hypoxique dans ce système expérimental de protoplaste de chou.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig01.jpg"> 
Figure 1 : Représentation graphique du flux de travail d’isolement des protoplastes. Cette figure illustre le processus étape par étape impliqué dans l’isolement des protoplastes du tissu foliaire du chou. Le flux de travail est représenté visuellement pour fournir une compréhension claire de la procédure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig02v2.jpg"> 
Figure 2 : Isolement du protoplaste dans le tissu foliaire du chou. (A) L’apparition des variétés de chou commerciales 'Fuyudori' et '228' au stade de croissance recommandé est montrée. Les deuxièmes feuilles vraies nouvellement complètement développées (indiquées par la pointe de flèche) des choux au stade 2 feuilles sont sélectionnées pour l’isolement des protoplastes. Barre d’échelle : 2 cm. (B) Une pompe à vide et un dessiccateur sont utilisés pour le processus d’infiltration sous vide des lamelles de feuilles de chou, avec une infiltration de 30 minutes effectuée avant la digestion enzymatique. (C) L’état des lamelles de feuilles de chou pendant la digestion enzymatique est décrit. La digestion complète du tissu foliaire nécessite un total de 4 à 16 heures. Barre d’échelle : 3 cm. (D) Les photos montrent l’utilisation d’un concentrateur d’oxygène relié à une pierre à air pour augmenter la concentration d’oxygène dissous dans la solution W5. Barre d’échelle : 5 cm. (E) Plus de 4,00 x 106 protoplastes du mésophylle par gramme de poids frais (FW) ont été obtenus à partir des variétés de chou 'Fuyudori' et '228' et ont été observés au microscope. Barre d’échelle : 200 μm. (F) L’efficacité de transfection des protoplastes des deux génotypes de choux, à l’aide d’un rapporteur GFP exprimé de manière constitutive, est supérieure à 40 %. Barre d’échelle : 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig03.jpg"> 
Figure 3 : Réponse à l’hypoxie des protoplastes du chou dans des conditions de carence en oxygène. (A) Les constructions géniques de la réponse à l’hypoxie, les promoteurs BoADH1 et BoSUS1L, sont utilisées comme rapporteurs pour évaluer la réponse à l’hypoxie dans les protoplastes du chou 'Fuyudori'. (B) Un total de 5 μg de plasmides rapporteurs est transfecté dans des protoplastes de chou 'Fuyudori', qui sont incubés dans une solution W5 à bulles d’oxygène avant d’être exposés à des traitements d’hypoxie pendant 4 heures. Les niveaux d’oxygène sont réduits pendant l’incubation en ajoutant de l’EC-oxyrase (0,6 unité·mL-1), de l’OxyFluor (0,6 unité·mL-1) et du sulfite de sodium (1 g·mL-1) à la solution W5. Le traitement de l’absorbeur d’oxygène est effectué en plaçant deux sacs d’absorption d’oxygène dans un bocal anaérobie de 3,5 L. Le groupe « CK » représente le groupe témoin sans aucun traitement contre l’hypoxie. Après le traitement, les protoplastes sont récoltés pour un double dosage de la luciférase. Chaque valeur représente la moyenne ± écart-type, avec n = 4. Des lettres différentes indiquent des différences significatives (P &lt; 0,05) sur la base d’une ANOVA à un facteur avec test post-hoc LSD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Préparation de la solution enzymatique, de la solution W5 et de la solution MMG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Détails du plasmide pour la transfection des protoplastes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Plasmids.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Mise au point d’un système protoplaste du chou pour l’étude de la tolérance à l’hypoxie chez les brassicacées

As climate change brings more heavy rainfall, cabbage, a key Brassicaceae vegetable, faces significant yield losses due to flooding-induced hypoxia ...

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