Inactivation du gène CRISPR-Cas9 médiée par électroporation dans les cellules THP-1 et isolement de clones unicellulaires

Mes activités de recherche portent sur la compréhension des mécanismes qui rendent les macrophages résistants à l’infection par le VIH, le virus responsable de la pandémie de sida. En particulier, nous nous concentrons sur l’activité de l’enzyme appelée HT-1 qui dégrade les NTP, les éléments constitutifs des génomes viraux. Mais cette enzyme a aussi d’autres activités que nous essayons d’élucider.

Nous avons établi un protocole pour modifier génétiquement les cellules THP1. Ces cellules sont un substitut bien établi pour les macrophages humains à étudier. Par exemple, la réplication du VIH-1.

Ces cellules sont difficiles à transfecter pour manipuler leur teneur en protéines. Par conséquent, nous établissons des méthodes pour manipuler leur génome à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. De la conception des ARN SG jusqu’à la validation des populations polyclonales et monoclonales.

Notre protocole vise à réaliser une édition à haute efficacité d’un gène d’intérêt dans les cellules THP1 qui sera électroporé avec des complexes ribonucléoprotéiques préassemblés fabriqués par les ARN d’énergie nucléase Cas9. Dans cette approche, l’activité de Cas9 est limitée dans le temps. Cela réduit la possibilité de générer des effets cibles qui se produisent souvent lorsque des vecteurs lenti sont utilisés.

Et dans ce cas, en effet, l’expression de Cas9 prolonge le temps et peut donc être dommageable pour la cellule. Pour commencer, remplissez chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits avec 500 microlitres de milieu RPMI 1640 sans antibiotique et complété par 20 % de FBS inactivé et filtré par la chaleur. Placez la plaque dans un incubateur humidifié pendant la nuit.

Pour réhydrater le guide unique sec ou les ARNsg à une concentration finale de 100 micromolaires, ajoutez 10 microlitres de tampon TE pour un nano mol d’ARNsg. Vortex la solution pendant 30 secondes et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour assurer une réhydratation complète. Le lendemain, pour préparer la solution d’ARNsg de travail de 30 micromolaires, homogénéisez d’abord brièvement la solution mère d’ARNg de 100 micromolaires à l’aide d’une pipette, puis diluez la tige dans de l’eau exempte de nucléases.

Agitez la solution pendant 30 secondes et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Diluez un microlitre de chacune des trois, 30 solutions de travail de l’ARNg micromolaire et 0,5 microlitre de la solution Cas9 de 20 micromolaires dans 3,5 microlitres de tampon de remise en suspension R, pour assembler les ribonucléoprotéines de l’ARNg Cas9 et ajoutez un rapport molaire de un à neuf. Agitez brièvement et laissez incuber pendant cinq minutes à température ambiante.

Pour préparer un contrôle non édité, ajoutez 0,5 microlitre de solution Cas9 à 20 micromolaires à 6,5 microlitres de tampon de résuspension R.Vortex brièvement et incubez pendant cinq minutes à température ambiante, ajoutez cinq microlitres de tampon de résuspension R aux échantillons pour obtenir un volume final de 12 microlitres par condition d’électroporation. Pour préparer les cellules THP-1 après le comptage des cellules, prélevez un volume équivalent à 0,2 fois 10 à la puissance six des cellules THP-1 et centrifugez-les à 336G pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius, aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de PBS. Centrifugez à nouveau et mettez en suspension la pastille cellulaire dans les 12 microlitres de solution de ribonucléoprotéines.

Pour mettre en place le système d’électroporation, placez la station de pipette sous une enceinte de biosécurité et positionnez un tube d’électroporation à l’intérieur de l’armoire, ajoutez trois millilitres de tampon E du kit d’électroporation dans le tube d’électroporation. Allumez le dispositif d’électroporation et utilisez l’écran tactile pour régler les paramètres d’électroporation, tension à 1 500 volts. Durée jusqu’à 10 millisecondes.

Et le nombre jusqu’à trois. Équipez la pipette d’électroporation d’un embout et aspirez 10 microlitres de la solution de ribonucléoprotéine THP-1. Insérez la pipette dans le tube d’électroporation et appuyez sur Start sur l’écran de l’appareil d’électroporation.

Attendez que le message complete s’affiche et retirez la pipette du tube. Transférez les cellules THP-1 dans un puits de la plaque de culture préchauffée à 24 puits et homogénéisez doucement l’échantillon. Remettez la plaque dans l’incubateur humidifié et laissez les cellules reposer sans être dérangées pendant 72 heures.

Après l’électroporation et le comptage des cellules, prélevez un volume équivalent à 0,1 fois 10 à la puissance de six cellules THP-1 dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugez les cellules à 336G pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius et aspirez le surnageant avant de remettre le granulé en suspension dans 500 microlitres de PBS. Encore une fois, centrifugez les cellules, aspirez autant de surnageant que possible sans déranger la pastille et congelez la pastille.

Pour l’extraction de l’ADN génomique, remettre en suspension la pastille avec 50 microlitres de solution d’extraction d’ADN. Homogénéisez-le et transférez tout le volume dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Faites vortex le tube et centrifugez-le brièvement pendant une impulsion de trois secondes.

Placez le tube dans un thermocycleur et chauffez à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, diluez l’ADN extrait avec 90 microlitres d’eau ultrapure, vortex et centrifugez brièvement à 5000G pendant trois secondes. Diluez l’amorce PCR dans de l’eau ultrapure jusqu’à une concentration finale de 10 micromoles.

Préparez le mélange PCR dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Placez les tubes PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme avec les paramètres spécifiés. Pour les populations polyclonales modifiées dans un nouveau tube de 0,2 millilitre.

Mélangez 17,5 microlitres de l’amplicon PCR avec deux microlitres de tampon E deux pour un volume final de 19,5 microlitres. Vortex la solution et la centrifugeuse brièvement, alternativement, pour le criblage de clones de cellules uniques, mélangent les produits de PCR des cellules de contrôle modifiées et non éditées dans un rapport de un à un. Pour la formation en duplex hétéro, placez les tubes dans un thermocycleur et exécutez le programme donné.

Après la formation de l’hétéro duplex, ajoutez 0,5 microlitre de solution d’endonucléase T sept dans le tube et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour préparer les échantillons à l’électrophorèse sur gel, mélangez cinq microlitres d’endonucléase T7, un produit de digestion ou un produit PCR non digéré avec cinq microlitres d’eau et deux microlitres de six colorants de chargement d’ADNx, chargez les échantillons et l’échelle de taille dans le gel et faites fonctionner le gel à 80 volts pendant 45 minutes. L’édition de gènes du locus EGFP médiée par CRISPR Cas9 a entraîné une forte baisse des cellules positives à la GFP, atteignant une réduction de plus de 90 % au septième jour après l’électroporation.

Le troisième jour après l’électroporation, le nombre de cellules avait diminué de moitié en raison du stress induit par l’électroporation, mais s’est complètement rétabli le septième jour dans un milieu RPMI complet. L’endonucléase T7, disons et l’électrophorèse sur gel d’Agarose ont démontré la perte d’environ 75 fragments de paires de bases dans les cellules modifiées, confirmant l’édition CRISPR du site cible de l’EGFP.