Modèle de biofilm agrégé de fibrose kystique pour étudier l’expression génique liée à l’infection

Notre recherche développe un modèle de biofilm agrégé dans des expectorations artificielles pour reproduire les infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose. Ce modèle nous permet d’analyser les changements d’expression génique et de comprendre pourquoi les bactéries deviennent plus résistantes aux traitements dans ces conditions par rapport aux environnements standard de test de médicaments. Le développement d’un modèle complexe de biofilm a mis en évidence les défis liés à la récapitulation de l’environnement pulmonaire hostile, ce qui rend difficile de prédire si les effets antimicrobiens in vitro s’alignent sur les résultats in vivo.

La nature spécifique des infections pulmonaires de la mucoviscidose complique davantage la mise au point de modèles de laboratoire efficaces pour tester les antimicrobiens. Tout au long de cette recherche, nous avons réussi à créer un modèle de biofilm d’agrégats polymicrobiens, qui fournit une plate-forme pour tester des antimicrobiens dans un environnement réaliste, montre le niveau de résistance qui peut être observé dans ces biofilms et met en évidence le potentiel des thérapies anti-virulence ciblant des composants tels que l’alginate. Le fait de disposer d’un modèle de test antimicrobien conçu pour imiter l’environnement pulmonaire de la FK comblera l’écart qui existe entre les tests in vivo et in vitro.

De plus, l’évaluation du virome des bactéries dans un environnement qui ressemble davantage à un poumon de mucoviscidose permettra de mettre au point et de tester des traitements anti-virulente. Pour commencer, faites passer une seule perle de Pseudomonas aeruginosa PAO1 à partir de cultures de stock de billes congelées sur une vis en bouillon de lysogénie. Incuber la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Pour la préparation d’un biofilm monospécifique, préparez des cultures de nuit de Pseudomonas aeruginosa PAO1 avec une seule colonie à partir de la plaque striée et incubez pendant la nuit pendant 18 heures. Ensuite, diluez la culture à une densité optique de 0,05 à 600 nanomètres, ce qui équivaut à 1 fois 10 à la puissance 8 unités formant colonies par millilitre. De plus, diluez cette culture de 1 à 100 dans un milieu SCFM2.

Ensuite, ajoutez 180 microlitres de l’inoculum dans les puits d’une plaque de microtitration à fond rond de 96 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius tout en agitant à 75 tours par minute pendant 24 heures. Réactiver Pseudomonas aeruginosa PAO1 et staphylococcus aureus SH1000 à partir de cultures de billes congelées, comme démontré précédemment.

Faites revivre le candida albican CAF 2.1 sous la forme d’une seule traînée de billes sur l’gélose au dextrose sabouraud, et incubez les plaques pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Préparez des cultures de nuit de staphylocoque doré et de candida albicans avec des colonies uniques à partir de leurs plaques de stries respectives dans 5 millilitres de bouillon de lysogénie. Diluer les cultures normalisées pour former un seul inoculum contenant les deux espèces aux concentrations requises dans SCFM2.

Ensuite, ajoutez 162 microlitres de l’inoculum mixte dans les puits d’une plaque de microtitration de 96 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius tout en l’agitant à 75 tours par minute pendant 24 heures pour permettre la formation de biofilms multi-espèces. Ensuite, ajoutez 14,2 microlitres de la culture de nuit préparée de pseudomonas aeruginosa dans les puits de la plaque de microtitration de 96 puits, et incubez à nouveau la plaque pour permettre la formation d’un biofilm polymicrobien.

Pour commencer, obtenez des biofilms monospécifiques et multi-espèces dans des plaques de microtitration à 96 puits. Pour perturber le biofilm, ajoutez 8,81 microlitres de stock de DNase 1 directement dans les puits contenant les biofilms, atteignant une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius tout en secouant à 75 tours par minute.

Obtenez une solution mère d’antibiotiques de méropénème à 2,56 milligrammes par millilitre. Effectuez des dilutions en série d’un facteur deux pour obtenir une plage de concentration de 0,01 milligramme par millilitre à 2,56 milligrammes par millilitre. Maintenant, ajoutez 20 microlitres de chaque dilution de miropénème aux biofilms, ce qui permet d’obtenir une plage de dosage de 1 microgramme par millilitre à 256 microgrammes par millilitre.

Scellez la plaque de microtitration à 96 puits avec un film transparent et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 24 heures tout en la secouant à 75 tours par minute. Les biofilms de pseudomonas d’une seule espèce n’ont montré aucune diminution significative des cellules viables lorsqu’ils étaient traités avec du méropénème à n’importe quelle dose allant jusqu’à 256 microgrammes par millilitre. Le taux de récupération de Pseudomonas aeruginosa était supérieur de 0,74 log 10 unités de formation de colonies par millilitre dans les environnements monospécifiques par rapport aux environnements polymicrobiens sans antibiotiques.

Pour commencer, préparez les biofilms monospécifiques et multi-espèces pour l’extraction de l’ARN. Après l’incubation, transférez les biofilms de chaque puits dans un microtube à centrifuger d’un millilitre regroupant les réplications du biofilm pour chaque échantillon. Centrifugez le tube à 16 000 G pendant cinq minutes.

Si l’extraction de l’ARN est effectuée plus tard, retirez le surnageant et stockez la pastille dans 250 microlitres de solution de stabilisation de l’ARN à 80 degrés Celsius. Plus tard, décongelez le tube avec des granulés à température ambiante et centrifugez-le à 16 000 G pendant cinq minutes. Remettez la pastille en suspension dans 600 microlitres de réactif TRIzol et perturbez-la manuellement à l’aide d’une aiguille de 0,2 millimètre attachée à une seringue de deux millilitres, en aspirant 5 à 10 fois, ou jusqu’à ce que la pastille soit complètement perturbée.

Suivez les directives du fabricant pour purifier l’ARN des biofilms perturbés. Pour quantifier l’ARN purifié, préparez la solution de travail avec 199 microlitres de tampon et un microlitre de réactif pour chaque échantillon. Mélangez 190 microlitres de la solution de travail et 10 microlitres de la solution standard un et standard deux dans des tubes séparés.

Ensuite, ajoutez 199 microlitres de la solution de travail et 1 microlitre de l’échantillon d’ARN dans des tubes individuels. Vortex pendant 30 secondes et stockez-le dans un endroit sombre pendant cinq minutes. Ensuite, sur le fluorimètre, sélectionnez ARN, puis ARN à large portée, puis suivez les instructions à l’écran.

Après avoir pris la lecture à blanc, pipetez un microlitre d’ARN sur le porte-échantillon du spectrophotomètre et mesurez l’absorbance à 260 par 280 nanomètres. Pour la synthèse complémentaire de l’ADN, préparez le mélange réactionnel dans des tubes. Placez les tubes dans un thermocycleur et lancez le programme.

Utilisez le CDNA immédiatement ou stockez-le à 80 degrés Celsius. L’expression d’algD dans les biofilms monospécifiques de pseudomonas aeruginosa n’a pas varié de manière significative entre les concentrations de méropénème. Dans les biofilms polymicrobiens, l’expression d’algD était significativement plus élevée à 256 microgrammes par millilitre, ce qui indique une augmentation de la production d’alginate en présence d’organismes co-colonisateurs.