Name: Modèle de biofilm agrégé de fibrose kystique pour étudier l’expression génique liée à l’infection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Découvrez un modèle de biofilm polymicrobien pour étudier l'expression génique et la résistance aux antimicrobiens dans les infections pulmonaires liées à la fibrose kystique. Cette méthode aide à développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces.

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HL, DN et JF ont reçu une subvention pour le Centre de recherche stratégique (SRC) Un cadre préclinique fondé sur des données probantes pour le développement de thérapies antimicrobiennes dans la fibrose kystique (PIPE-CF ; N° de projet SRC 022) du UK Cystic Fibrosis Trust et de la US Cystic Fibrosis Foundation. TH est soutenu par une bourse de doctorat du MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnership. Nous remercions le CF Trust et la Fondation CF (SRC022) ainsi que le programme de PAD MRC DiMEN pour le financement

1. Préparation de biofilms monospécifiques
<ol>
	<li>Ranimer P. aeruginosa PAO1 à partir de cultures mères de billes congelées en striant une seule bille sur une gélose au bouillon de lysogénie (LB) et en l’incubant pendant 24 h à 37 °C.</li>
	<li>Préparez des cultures de PAO1 pendant la nuit en prélevant une seule colonie de la plaque de stries et en l’ajoutant à un milieu de 5 mL LB. Incuber pendant la nuit (18 h), puis diluer à une DO600 de 0,05 (équivalant à 1 x 108 UFC/mL), puis diluer à 1:100 dans du SCFM2 préparé selon Palmer, et al.16.</li>
	<li>Ajouter 180 μL de l’inoculum dans les puits d’une plaque de microtitration à fond rond de 96 puits. Préparer les biofilms en triple exemplaire biologique pour le dénombrement par unités formant colonies (UFC). Au total, 3 répétitions par répétitions biologiques sont effectuées pour la qPCR uniquement. À 3 puits séparés, ajoutez 180 μL de SCFM2 stérile à utiliser pour les contrôles des milieux. 
	REMARQUE : Les plaques à fond rond ont été sélectionnées par opposition aux plaques à fond plat traditionnelles en raison de leur supériorité pour permettre une exposition homogène de l’ensemble du biofilm au milieu de croissance environnant 17.</li>
	<li>Laisser les biofilms se former pendant 24 h, en incubant à 37 °C et en agitant à 75 tr/min.</li>
</ol>
2. Préparation de biofilms multi-espèces
<ol>
	<li>Réactiver P. aeruginosa PAO1 et S. aureus SH1000 à partir de cultures de billes congelées décrites ci-dessus. Faire revivre C. albicans CAF2.1 à partir de cultures de billes congelées en striant une seule bille sur de la gélose au dextrose Saboraud et en l’incubant pendant 24 h à 37 °C.</li>
	<li>Préparez des cultures de nuit de SH1000 et de CAF2.1 en prélevant une seule colonie de la plaque de stries et en ajoutant 5 mL de LB (cultures de nuit distinctes pour chaque organisme). Incuber toute la nuit pendant 18 h. Normaliser les cultures de nuit de S. aureus SH1000 et de C. albicans CAF2.1 en LB à des valeurs OD600 de 0,1, ce qui équivaut à 1 x 109 et 1,2 x 107 UFC/mL, respectivement17,18.</li>
	<li>Diluer S. aureus et C. albicans pour former un seul inoculum contenant les deux espèces à des concentrations de 1 x 106 et 1 x 105 UFC/mL, respectivement, dans la SCFM2.</li>
	<li>Ajouter 162 μL de l’inoculum dans les puits d’une plaque de microtitration de 96 puits. Inoculer des biofilms en trois exemplaires biologiques pour le dénombrement par unités formant colonies (UFC). Au total, 3 répétitions par répétitions biologiques sont effectuées pour la qPCR uniquement. À 3 puits séparés, ajoutez 180 μL de SCFM2 stérile à utiliser pour les contrôles des milieux.</li>
	<li>Laisser les biofilms se former pendant 24 h, en les incubant à 37 °C et en les agitant à 75 tr/min.</li>
	<li>Préparez une culture de PAO1 pendant la nuit en prélevant une seule colonie de la plaque striée et en l’ajoutant à 5 mL de milieu LB. Incuber pendant la nuit (18 h), puis ajouter à une dose de600 OD de 0,05 (équivalant à 1 x 108 UFC/mL), puis diluer à 1 x 105 UFC/mL dans SCFM2.</li>
	<li>Ajouter 14,2 μL de l’inoculum PAO1 dans les puits de la plaque de microtitration à 96 puits, ce qui donne un inoculum final du PAO1 de 1 x 104 UFC/mL. 
	REMARQUE : Cette variation de la concentration de l’inoculat entre les différentes espèces vise à s’assurer que le S. aureus et le C. albicans ne sont pas supplantés par le P. aeruginosa et qu’ils peuvent tous être récupérés par placage ponctuel à partir du biofilm de 24 heures où aucun antibiotique n’est présent.</li>
	<li>Laisser les biofilms polymicrobiens se former pendant 24 h, en incubant à 37 °C et en agitant à 75 tr/min.</li>
</ol>
3. DNase et traitement antibiotique des biofilms monospécifiques et multi-espèces
<ol>
	<li>Ajouter 2 μL de DNase I directement dans les puits contenant les biofilms à une concentration finale de 50 μg/mL, incuber pendant 1 h à 37 °C et agiter à 75 tr/min. 
	REMARQUE : Ceci est ajouté pour diluer les biofilms visqueux afin de permettre une meilleure pénétration des antimicrobiens, reflétant la dose de rhDNase (DNase humaine recombinante) qui est prise par de nombreuses personnes atteintes de mucoviscidose comme stratégie de gestion des exacerbations pulmonaires.</li>
	<li>Préparez un stock d’antibiotiques de méropénème à 2,56 mg/mL, en utilisant de l’eau distillée comme diluant. Diluer en série d’un facteur de 2 pour atteindre des concentrations de 0,01 mg/mL à 2,56 mg/mL.</li>
	<li>Ajouter 20 μL de chaque dilution de méropénème aux biofilms pour obtenir une plage de dosage de 1 μg/mL à 256 μg/mL. Ajouter 20 μL d’eau distillée aux biofilms de contrôle négatif à la place de l’antibiotique.</li>
	<li>Scellez la plaque de microtitration à 96 puits avec un film transparent et incubez à 37 °C pendant 24 h, en agitant à 75 tr/min.</li>
</ol>
4. Énumération des cellules viables et de l’activité métabolique
REMARQUE : Les étapes suivantes concernent uniquement les biofilms destinés à la quantification des UFC.
<ol>
	<li>Ajouter 10 μL de cellulase (100 mg/mL, 0,05 M de tampon de citrate) dans des biofilms et incuber à 37 °C pendant 1 h en agitant à 140 tr/min. La cellulase est régulièrement utilisée pour perturber les squelettes de cellulose au sein des biofilms19,20,21. Perturbez davantage les biofilms en pipetant de haut en bas si nécessaire jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’amas visibles.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de solution de résazurine à 0,02 % pour évaluer l’activité métabolique des biofilms d’essai et des biofilms témoins, puis incuber à 37 °C pendant 1 h, en agitant à 140 tr/min.</li>
	<li>Mesurez la fluorescence de chaque puits à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 540 nm et d’une longueur d’onde d’émission de 590 nm dans le lecteur de microplaques.</li>
	<li>Corriger la fluorescence de fond en soustrayant les valeurs de fluorescence des échantillons de milieux vierges et calculer le pourcentage de réduction comme suit : (moyenne desbiofilms traités aux antibiotiques/moyenne Fdu contrôle négatif) x 100 %.</li>
	<li>Énumérer le contenu des puits, contenant à la fois les biofilms perturbés et les cellules planctoniques, par dilution en série et placage ponctuel sur gélose sélective comme suit : 
	Gélose sélective Pseudomonas supplémentée avec 1 % de glycérol et supplément de CN pour le dénombrement de P. aeruginosa 
	Gélose au sel mannitol pour le dénombrement de S. aureus| 
	Gélose de levure peptonée dextrose additionnée de pénicilline (250 μg/ml), de streptomycine (250 μg/ml), de sulfate de gentamycine (30 μg/ml) et de vancomycine (3 μg/ml) pour le dénombrement de C. albicans. 
	REMARQUE : L’ensemble du contenu des puits est énuméré en raison des défis liés à la séparation du biofilm d’agrégats flottant librement des cellules planctoniques. Cependant, cette approche reflète plus précisément les conditions présentes dans le poumon de la mucoviscidose. De la condensation peut être présente sur le couvercle après l’incubation. Pour éviter toute contamination entre les puits, placez les commandes stériles sur une gélose sélective.</li>
	<li>Après le placage ponctuel sur la gélose sélective, incuber les plaques pendant 24 h à 37 °C avant de procéder au dénombrement.</li>
</ol>
5. Préparation des biofilms pour l’extraction de l’ARN
REMARQUE : Toutes les étapes à partir de ce moment concernent uniquement les biofilms destinés à l’analyse RT-qPCR.
<ol>
	<li>Retirer la plaque de microtitration à 96 puits contenant les biofilms de l’incubateur à 37 °C et les transférer dans un tube de microcentrifugation de 1 mL. Lors du transfert, assurez-vous que les réplicats du biofilm sont regroupés pour chaque répétition biologique effectuée. Cela garantit qu’il y a suffisamment de biomasse pour l’extraction de l’ARN.</li>
	<li>Centrifuger les tubes de 1,5 mL contenant les biofilms à 16 000 x g pendant 5 min. Si vous effectuez l’extraction de l’ARN le même jour, passez à l’étape 6.2.1. Si l’extraction de l’ARN n’est pas effectuée le même jour, retirer le surnageant et stocker la pastille dans 250 μL de solution de stabilisation de l’ARN à -20 °C. Cette solution a été utilisée pour stocker des granulés bactériens dans plusieurs études22,23.</li>
</ol>
6. Extraction de l’ARN
<ol>
	<li>Extraire des biofilms d’ARN bactérien monospécifiques et multi-espèces à l’aide d’un kit commercial. Préparez les tampons comme indiqué dans les instructions du fabricant.</li>
	<li>Retirer le surnageant du milieu de culture et le jeter. Si la pastille a été stockée dans une solution de stabilisation, décongelez-la à température ambiante et centrifugez-la à 16 000 x g pendant 5 min. Remettre la pastille en suspension dans 600 μL de réactif d’extraction d’ARN, puis la perturber manuellement à l’aide d’une aiguille de 0,2 mm fixée à une seringue de 2 mL (aspirer 5x-10x ou jusqu’à ce que la pastille soit complètement perturbée).</li>
	<li>Effectuez les étapes de purification de l'ARN comme indiqué dans les directives du fabricant.</li>
	<li>Quantifiez l’ARN à l’aide d’un spectroscope UV, d’un kit de dosage de l’ARN BR et de tubes. Les limites détectables d’ARN à l’aide du kit de dosage sont de 10 à 1200 ng/μL, donc le rendement minimum acceptable d’ARN pour ce protocole est de 10 ng/μL.
	<ol>
		<li>Configurez le nombre de tubes requis pour les échantillons et les étalons (2 étalons sont nécessaires).</li>
		<li>Préparez la solution de travail en ajoutant 199 μL de tampon et 1 μL de réactif par nombre d’échantillons (+ 2 étalons et 2 pour l’erreur).</li>
		<li>Ajouter 190 μL de solution de travail et 10 μL d’étalon 1 et d’étalon 2 dans des tubes séparés.</li>
		<li>Ajouter 199 μL de solution de travail et 1 μL d’échantillon d’ARN dans des tubes séparés. Agitez le votre appareil pendant 30 s, puis rangez-le dans un endroit sombre pendant 5 min.</li>
		<li>Sur le fluorimètre, sélectionnez ARN > ARN à large gamme et suivez les instructions.</li>
		<li>Évaluez la qualité de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Blanchir le spectrophotomètre en pipetant 1 μL d’eau libre DNase/RNase sur le spectrophotomètre. Essuyez l’eau à l’aide d’une lingette non pelucheuse et réglez le rapport d’absorbance sur 260/280 nM. Pipeter 1 μL d’ARN sur le spectrophotomètre. Si l’ARN est pur, un seul pic sera observé entre 260 et 280 nM, et un rapport de ~ 2,0 sera mis en évidence.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Convertissez l’ARN extrait en ADN complémentaire (ADNc) à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc. Pour tout échantillon d’ARN supérieur à 50 ng/μL, diluer d’abord à 50 ng/μL avec de l’eau exempte de DNase/RNase.
	<ol>
		<li>À l’aide de tubes, préparer le mélange de réaction de l’ADNc conformément au tableau 1.</li>
		<li>Placez les tubes dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : 25 °C pendant 5 min, 42 °C pendant 30 min, 85 °C pendant 5 min. Utilisez l’ADNc immédiatement ou conservez-le congelé à -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. qPCR
<ol>
	<li>Effectuez la qPCR à l’aide d’un qPCR Master Mix. Utilisez les amorces suivantes pour les gènes algD et ménagers (16S) (Tableau 2). 
	REMARQUE : Les amorces ont été conçues à l’aide de l’outil en ligne NCBI-primer Blast en référence à la séquence génomique complète de P. aeruginosa, puis synthétisées par un fournisseur commercial. La spécificité des amorces dans les biofilms polymicrobiens a été validée par correspondance de séquence à l’aide de l’outil NCBI-primer Blast.</li>
	<li>Diluez les amorces à 4 μM (4 pm/μL) en diluant 20 μL d’amorce dans 480 μL d’eau exempte de DNase/RNase. Ceux-ci peuvent être congelés pour de multiples utilisations.</li>
	<li>Préparez la solution de travail du mélange maître qPCR selon les instructions du Tableau 3. 
	REMARQUE : La solution de travail algD contient suffisamment de solution pour 3x répétitions biologiques et 3x répétitions techniques par concentration de méropénème, 6x contrôles négatifs et 2x erreur. Les solutions de travail 16S contiennent suffisamment de solution pour 2x les étalons de concentration d’ARN connue et 2x l’erreur.</li>
	<li>Ajouter 18 μL de solution de travail algD dans les tubes de réaction qPCR appropriés. Cela comprendra un total de 36 tubes pour l’analyse de l’expression d’algD et 6 tubes pour les contrôles négatifs.</li>
	<li>Ajoutez 2 μL d’ARN dans chacun des tubes de réaction qPCR ou 2 μL d’eau sans DNase/RNase aux témoins négatifs.</li>
	<li>Ajouter 18 μL de solution de travail 16S dans les tubes de réaction qPCR appropriés. Cela comprendra un total de 2 tubes. Ajouter 2 μL d’ARN de concentration connue dans les tubes de réaction qPCR.</li>
	<li>Effectuez la qPCR dans les conditions suivantes : 2 min à 95 °C, 15 s à 95 °C (40 cycles), 1 min à 60 °C.</li>
	<li>Analysez les résultats de la qPCR à l’aide de la méthode 2-ΔΔCt, comme décrit précédemment 24. Lors de l’analyse de l’expression d’algD, utiliser l’expression d’algD à 0 μg/mL comme contrôle pour les compositions respectives du biofilm et tenir compte de l’expression de changement de pli pertinente pour les cultures non traitées</li>.
</ol>

Anti-Infective Efficacy in Cystic Fibrosis with Aggregate Biofilm Models

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ces résultats montrent que, malgré son utilisation fréquente dans la prise en charge des exacerbations pulmonaires chez les personnes atteintes de mucoviscidose, le méropénème n’a pas influencé de manière significative la croissance de P. aeruginosa dans le modèle de biofilm monospécifique ou multispécifique. Une légère augmentation de la récupération de P. aeruginosa a été observée dans les deux modèles après un traitement avec 128 μg/mL et 256 μg/mL de méropénème, comme on l’a également observé pour S. aureus dans le biofilm multi-espèces ; Toutefois, ces augmentations ont été négligeables. La diminution de C. albicans lorsqu’il est soumis au méropénème peut être due à des conditions hostiles pour le champignon créé par la bactérie en réponse au stress de l’antimicrobien. Aucune différence significative n’a été observée dans l’expression d’algD entre les concentrations de méropénème lorsque P. aeruginosa a été cultivé sous forme de biofilm monospécifique. Cependant, l’expression d’algD était significativement plus élevée dans les biofilms multi-espèces lorsqu’ils étaient traités avec 256 μg/mL de méropénème, ce qui suggère que la production d’alginate pourrait être augmentée dans ces conditions. Les différences d’expression d’algD observées entre les compositions du biofilm et les concentrations de méropénème montrent comment la présence de facteurs pertinents peut influencer l’expression génique pertinente pour l’infection et soulignent l’importance de prendre en compte l’utilisation des antimicrobiens et le statut d’infection polymicrobienne lors de l’élaboration et de l’essai d’alternatives antibiotiques.
Malgré l’utilité des modèles, il y a plusieurs considérations pour assurer une application réussie. L’établissement de S. aureus et de C. albicans dans les biofilms est essentiel avant l’infection par P. aeruginosa, en raison des risques que S. aureus et C. albicans soient supplantés par le Gram négatif. Dans ce modèle de biofilm, C. albicans semble être un mauvais partenaire en raison de ses taux de survie significativement plus faibles que ceux de S. aureus et P. aeruginosa, même en l’absence d’antibiotiques. Cela suggère que la levure est soit concurrencée pour les ressources, soit négativement affectée par les interactions interespèces au sein du biofilm27,28. L’absence de C. albicans en présence de méropénème, bien que l’antibiotique n’ait pas d’activité antifongique directe, soutient l’idée que la réponse au stress de S. aureus au méropénème peut créer un environnement inhospitalier pour C. albicans29,30. Cependant, il est important de noter que le choix de la souche peut avoir un effet sur la quantité de C. albicans qui peut être récupérée à partir du modèle de biofilm polymicrobien. Des tendances différentes sont observées lors de l’utilisation de P. aeruginosa LESB58 au lieu de PAO1 (figure supplémentaire 1). Avec LESB58, C. albicans est récupérable à toutes les concentrations de méropénème et montre en fait une légère augmentation à mesure que la concentration de P. aeruginosa diminue à la suite de l’antimicrobien, ce qui permet à la composition de la communauté de changer. Cependant, malgré ces différences, PAO1 est utilisé dans ce modèle parce qu’il s’agit d’une souche de référence en laboratoire, ce qui fournit une base de référence cohérente et bien caractérisée pour les études comparatives. Cette cohérence est cruciale pour la reproductibilité et pour tirer des conclusions fiables sur les interactions au sein du biofilm.
Il peut être difficile d’extraire de grandes quantités d’ARN à partir de bactéries cultivées dans SCFM2, en raison de la nature visqueuse du milieu. Par conséquent, la rupture du biofilm avec des aiguilles de 0,2 mm avant l’extraction de l’ARN est une étape importante pour augmenter le rendement en ARN et garantir que des concentrations suffisantes (≥10 ng/μL) sont extraites pour la RT-qPCR. L’ARN est très sensible à la dégradation31, donc après l’extraction, assurez-vous que toutes les activités en aval qui utilisent l’ARN sont effectuées sur de la glace. La congélation-décongélation régulière de l’ARN, de l’ADNc et des amorces qPCR peut augmenter la probabilité de dégradation du produit. Par conséquent, il doit être limité autant que possible. Un autre défi commun dans l’application de ces modèles est le risque de contamination lors de l’extraction de l’ARN ou du test qPCR. Ce risque peut être minimisé en pulvérisant l’équipement avec une solution de dégradation de l’ADN avant l’extraction de l’ARN et en utilisant des pointes de pipette sans DNase/RNase tout au long de la procédure. Le remplacement régulier de l’eau exempte de DNase/RNase contribuera également à réduire le risque de contamination dans le test qPCR.
Ce protocole a choisi de se concentrer sur l’algD en tant que gène d’intérêt en raison de sa nécessité dans la production d’alginate, qui est décrit comme un facteur clé de virulence de P. aeruginosa lors d’infections aiguës et chroniques32. Ainsi, l’alginate est de plus en plus étudié comme cible pour les traitements anti-virulence33,34. Bien que ce modèle ait été utilisé pour évaluer l’expression de l’algD, il peut être appliqué pour évaluer l’expression d’autres gènes de P. aeruginosa pour différentes cibles de médicaments anti-virulence. Le méropénème a été utilisé dans cette étude en raison de preuves suggérant que l’antibiotique influence l’expression des gènes de biosynthèse de l’alginate, en particulier lorsque P. aeruginosa est cultivé en présence de C. albicans35. De plus, le méropénème est souvent prescrit cliniquement pour traiter et gérer les infections respiratoires à P. aeruginosa, ce qui souligne son utilisation pertinente dans ce modèle36. Cependant, l’ajout de différents antibiotiques, voire de traitements en alternance, est également possible avec ces modèles. L’incorporation d’antibiotiques dans ce modèle permettrait également d’utiliser ce modèle pour étudier les changements évolutifs dans les mécanismes de résistance bactérienne, tels que le développement de la résistance médiée par les porines de P. aeruginosa aux carbapénèmes37. Ce modèle de biofilm polymicrobien pourrait être adapté pour inclure d’autres espèces pertinentes, par exemple des bactéries commensales telles que Rothia sp. et Streptococcus sp., ou substitué par d’autres microbes infectieux tels que Aspergillus sp. pour refléter les exigences du candidat médicament examiné.
Des modèles de biofilms polymicrobiens qui imitent le poumon de la mucoviscidose ont été développés précédemment38. Le modèle décrit ici s’appuie sur des travaux antérieurs en vue d’augmenter le débit en utilisant une configuration adaptée aux cultures microbiennes de petit volume. Ceci est avantageux pour tester de nouveaux composés où le matériel disponible peut être limité. Comme le modèle est à petite échelle et statique, il est possible de faire croître les biofilms dans différentes disponibilités d’oxygène pour refléter plus étroitement l’environnement microaérophile dans les poumons39,40. Pour faciliter la reproductibilité et pour des raisons de rentabilité, les biofilms rapportés dans cette étude ont été cultivés en aérobie.
Malgré les précieuses connaissances tirées de cette étude, plusieurs limites doivent être reconnues. Tout d’abord, l’absence de cellules hôtes limite son utilité pour l’étude des facteurs de virulence qui ont une cible cellulaire directe chez les mammifères. Ce rapport souligne les défis que pose l’établissement de modèles in vitro adaptés à l’étude des facteurs de virulence et souligne la nécessité de développer davantage de modèles qui reproduisent l’environnement hostile des infections chroniques. De plus, bien qu’il soit considéré comme un facteur de virulence, l’alginate est une caractéristique clé des biofilms et est produit par P. aeruginosa à la fois en laboratoire et dans l’environnement. L’utilisation de modèles in vitro pour étudier les agents antibiofilm peut être moins difficile que l’utilisation des modèles pour étudier d’autres thérapies anti-virulence, telles que les agents anti-exotoxines, où la cible a une action directe sur les cellules eucaryotes41.
Bien que le choix de la souche PAO1 de P. aeruginosa soit approprié pour la reproductibilité et la standardisation du modèle in vitro , il peut être souhaitable d’inclure des isolats provenant d’une infection chronique. Des expérimentations futures utilisant ce modèle avec une souche isolée d’échantillons de patients seront menées afin d’observer l’effet des antimicrobiens sur des souches adaptées à la niche respiratoire.
L’utilisation de SCFM2 comme imitation des expectorations dans ce modèle in vitro permet une observation standardisée et reproductible des changements de comportement des biofilms agrégés cultivés dans un environnement pertinent pour les voies respiratoires au cours du traitement antibiotique. SCFM2 a été choisi par rapport à la version originale de SCFM en raison de l’inclusion d’ADN extracellulaire (ADNe) et de mucine, qui sont des facteurs importants dans le soutien de la formation de biofilms. Cependant, il est important de noter que d’autres variantes du milieu d’expectoration synthétique sont également disponibles, telles que SCFM3, qui contient de l’acide p-aminobenzoïque, du NAD+, de l’adénine, de la guanine, de la xanthine et de l’hypoxanthine42, et SCFM4, qui est une version carencée en fer. De plus, l’utilisation de milieux synthétiques pour expectorations, tels que les milieux pulmonaires pour la fibrose kystique (CFLM) et les milieux pour les sinus de la fibrose kystique (CFSM), développés par Ruhluel et ses collègues43, permettraient de compartimenter les voies respiratoires pour visualiser le comportement et l’effet des traitements anti-virulence sur les biofilms polymicrobiens dans différents environnements.
Bien que l’AlgD soit une enzyme clé dans la voie de biosynthèse de l’alginate, son niveau d’expression seul ne doit pas être considéré comme une indication de la production d’alginate. D’autres facteurs, tels que les modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles, ainsi que les mécanismes de régulation, peuvent influencer la quantité d’alginate produite, entraînant une réduction de la formation de biofilms, une sensibilité accrue au stress environnemental et une sensibilité accrue aux antibiotiques lorsque la production d’alginate est réduite12,14. Il existe plusieurs traitements anti-virulence en cours de développement qui ciblent la protéine alginate lorsque ce modèle ne serait pas approprié pour déterminer leur efficacité et qu’il serait plus bénéfique de mesurer directement la production d’alginate ou une lecture fonctionnelle44. De plus, certains traitements anti-virulence peuvent cibler différentes étapes de la biosynthèse ou de la régulation de l’alginate, de sorte que la mesure de la production d’alginate capture directement l’effet net du traitement sur le facteur de virulence44. Néanmoins, plusieurs des traitements anti-virulence dans les études actuelles ciblent les gènes clés de l’alginate, et des modèles d’expression génique tels que ceux-ci seraient appropriés pour étudier les effets de ces thérapies13,14. De telles techniques peuvent également être facilement adaptées pour le criblage à haut débit, permettant l’évaluation rapide de plusieurs échantillons ou conditions, ce qui est bénéfique dans les études à grande échelle impliquant le dépistage initial de composés anti-virulence potentiels.
Dans l’ensemble, les modèles de biofilms monospécifiques et multi-espèces représentent des outils précieux pour étudier l’expression des gènes de P. aeruginosa pertinents pour l’infection dans des conditions appropriées à la FK. Le déploiement à grande échelle de la thérapie modulatrice a révolutionné le paysage des soins de santé pour la fibrose kystique. Cependant, malgré l’éventail d’avantages cliniques des modulateurs de la mucoviscidose, des études ont montré que deslignées clonales de Pseudomonas circulent jusqu’à ce que, soulignant que de nouvelles thérapies pour gérer les infections pulmonaires à P. aeruginosa sont toujours nécessaires45,46. Malgré les limites discutées, l’application de ces modèles pourrait être utile dans la phase de découverte du pipeline de développement de médicaments pour évaluer l’efficacité des composés dans le créneau pulmonaire de la FK et les interactions de nouveaux composés anti-virulence avec des antibiotiques connus dans cet environnement.

La mucoviscidose (FK) est la maladie autosomique récessive la plus fréquente au sein des populations caucasiennes1. Les mutations du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) entraînent une série de symptômes cliniques, notamment la surproduction de mucus dans les voies respiratoires. Une altération du transport des ions entraîne une déshydratation de ce mucus, ce qui fait qu’il n’est pas correctement éliminé par le système mucociliaire, ce qui augmente la susceptibilité aux infections pulmonaires chroniques1. La microbiologie du poumon de la mucoviscidose se compose d’un groupe distinct d’agents pathogènes opportunistes, Haemophilus influenzae et Staphylococcus aureus étant considérés comme des organismes primaires infectant les poumons des nourrissons et des enfants atteints de mucoviscidose, suivi d’un déclin de ces organismes et d’une colonisation ultérieure par Burkholderia spp., ou Pseudomonas aeruginosa à l’âge adulte1,2,3,4. En plus des espèces bactériennes, les micro-organismes fongiques sont également courants dans l’environnement pulmonaire de la mucoviscidose, Candida spp et Aspergillus spp étant parmi les espèces fongiques les plus souvent isolées3,4,5. Bien que ces organismes jouent un rôle important dans les infections pulmonaires de la mucoviscidose, les progrès des techniques de culture et des méthodes indépendantes de la culture ont montré que les infections pulmonaires de la mucoviscidose sont rarement limitées à une seule espèce bactérienne, mettant ainsi en évidence la nature complexe et polymicrobienne de la mucoviscidose lung1,6.
Malgré ces connaissances, les méthodes actuelles in vitro et in vivo pour la mise au point et l’essai d’antibiotiques destinés à être utilisés dans les infections pulmonaires chroniques ne ressemblent pas complètement à la niche pulmonaire de la mucoviscidose7, l’accent étant mis sur la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) du médicament contre des cultures monospécifiques. Cela ne tient pas compte du microenvironnement infectieux, qui est un élément clé de la pathologie pulmonaire de la mucoviscidose8. En tant que telles, les méthodes impliquent généralement la croissance des bactéries sous forme de cultures planctoniques, un état de croissance qui ne reflète probablement pas celui des bactéries dans le poumon de la FK. Ceci est particulièrement important pour P. aeruginosa, qui se présente généralement sous la forme d’agrégats de biofilm contenant souvent d’autres espèces bactériennes et fongiques 9. Ces facteurs présentent des défis lors de l’analyse des antibiotiques pour les infections pulmonaires chroniques et mettent en évidence une disparité entre les méthodes de test de sensibilité aux antibiotiques et l’activité antimicrobienne dans l’environnement pulmonaire de la mucoviscidose9,10. Ces défis sont exacerbés lors du dépistage d’antibiotiques alternatifs, tels que les traitements anti-virulence, où les tests de CMI ne sont pas un indicateur d’activité et ne permettent pas de comprendre les interactions hôte-pathogène 11.
Alginate, un polysaccharide extracellulaire, est un composant clé des biofilms de P. aeruginosa dans la niche pulmonaire et augmente la tolérance bactérienne aux antibiotiques et aux agents immunitaires, ainsi que l’amélioration de l’adhérence de surface12. L’alginate est une cible attrayante pour le développement d’un traitement anti-virulence, et plusieurs traitements ciblant la biosynthèse des alginates ont été développés, tels que ceux ciblant algD, un gène clé dans la biosynthèse des alginates<sup class="xref">13,14. De telles thérapies pourraient être utilisées en conjonction avec des antibiotiques chez les personnes atteintes de mucoviscidose pour perturber les biofilms de P. aeruginosa, convertissant les bactéries en un état planctonique. Cela augmente l’efficacité de l’antibiotique, car la perturbation de la matrice extracellulaire du biofilm permet à l’antibiotique d’atteindre la cible bactérienne 15. Cependant, malgré les preuves d’une activité in vitro, l’action de ces traitements dans la niche pulmonaire de la mucoviscidose reste incertaine.
Le modèle de biofilm agrégé présenté ici permet de résoudre ces problèmes par l’ajout de S. aureus et de C. albicans, qui sont des co-colonisateurs communs avec P. aeruginosa dans le poumon de la mucoviscidose. Il permet également à P. aeruginosa de se développer dans des agrégats de biofilm, comme on le voit dans l’environnement respiratoire. L’utilisation du milieu d’imitation des expectorations Synthetic Cystic Fibrosis Media 2 (SCFM2) comme environnement nutritionnel pour la croissance permet l’ajout d’influences de l’hôte, y compris la mucine, l’ADN (e)extracellulaire et un profil d’acides aminés qui reproduit celui observé dans le poumon de la mucoviscidose16.
Pour mieux saisir les conditions pulmonaires de la mucoviscidose, les biofilms sont exposés au méropénème, un antibiotique fréquemment prescrit aux personnes atteintes de mucoviscidose pendant les périodes d’exacerbation pulmonaire. L’utilisation d’un antibiotique dans ce modèle est recommandée comme moyen de reproduire les conditions cliniques dans lesquelles un agent anti-virulence peut être prescrit, par exemple, en tant que thérapie combinée associée à un traitement antibiotique pour gérer les symptômes respiratoires pendant l’exacerbation. De plus, l’inclusion du méropénème permet d’évaluer la réponse transcriptionnelle de P. aeruginosa à l’exposition aux antibiotiques dans des conditions pertinentes pour l’infection. Ce modèle pourrait être utilisé pour fournir de l’information sur les facteurs qui constitueraient des cibles médicamenteuses appropriées dans le poumon de la FK. Le modèle pourrait également être modifié pour inclure d’autres antibiotiques pertinents, tels que la tobramycine, et pour évaluer l’expression d’autres gènes d’intérêt.
Ici, ce modèle polymicrobien agrégé est utilisé pour évaluer les effets de la présence de Staphylococcus aureus et de Candida albicans et de concentrations variables de méropénème (1, 16 et 256 μg/mL) sur l’expression d’algD par P. aeruginosa. Le méropénème est prescrit pour traiter principalement les infections pulmonaires à P. aeruginosa et n’a pas d’effet direct sur S. aureus ou C. albicans, où la CMI pour ces deux espèces cohabitantes est de >256 μg/mL.
Ce travail permettra de mieux comprendre comment des facteurs pertinents, tels que les facteurs de l’hôte au sein de SCFM2 et les micro-organismes co-colonisateurs, peuvent influencer l’expression des gènes pertinents pour l’infection à P. aeruginosa et fournira les bases pour le développement et la mise à l’essai de traitements anti-virulence pour une utilisation dans les infections respiratoires chroniques de la FK.

<table><tbody><tr><td>Membrane d’étanchéité respirante pour plaques multipuits</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>Z763624</tr><tr><td>bec</td><td></td><td></td><td></td>Bunsen</tr><tr><td>Cellulase (100 mg/mL)</td><td>Cambridge Bioscience&nbsp ;</td><td>HY-B2220-5g</td><td></td></tr><tr><td>Supplément CN&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>1.07624</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans DNase/Rnase</td><td>VWR</td><td>J60610. XC</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycine sulfate (30 &micro ; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol (1 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514029</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix&nbsp ;</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>A6101</td><td></td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc iScript&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline (250 U/mL)</td><td>Fournitures de laboratoire Scientfic</td><td>P3032-10MU</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 4 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage de l’ARN BR Qubit&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10210</td><td></td></tr><tr><td>Tubes qubits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Solution de résazurine (0,02 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R12204</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Soln</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine (250 &micro ; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>Thermocycleur S9137</td><td></td></tr><tr><td>(nous avons utilisé le thermocycleur T100)</td><td>Réactif Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Vancomycine (3 & micro ; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>1709007</tr></tbody></table>

modèle de biofilm agrégé de fibrose kystique pour étudier l’expression génique liée à l’infection

Cystic Fibrosis Aggregate Biofilm Model to Study Infection-relevant Gene Expression

Les méthodes d’essai précliniques standard pour les nouveaux traitements antimicrobiens utilisés pour traiter les infections pulmonaires chroniques chez les personnes atteintes de mucoviscidose ne reflètent pas les conditions environnementales de la niche pulmonaire hostile. Les conditions actuelles d’essai réductionnistes peuvent conduire à la progression de composés le long d’un pipeline préclinique sans preuve de leur activité dans des conditions appropriées à la niche pulmonaire de la fibrose kystique. Plusieurs approches utilisées pour étudier les antimicrobiens traditionnels peuvent ne pas convenir aux alternatives antibiotiques, y compris les traitements anti-virulence comme les agents de détection anti-quorum et les inhibiteurs de sidérophore. Ce protocole documente un modèle de biofilm agrégé de Pseudomonas aeruginosa pour comparer la résistance et l’expression génique pertinente pour l’infection dans des cultures monospécifiques et multi-espèces (Staphylococcus aureus et Candida albicans), en examinant les réductions d’unités formant colonies (UFC) et les changements dans l’expression génique, en utilisant algD comme exemple. Le modèle a été optimisé pour de petits volumes statiques de cultures bactériennes afin de permettre l’étude de nouveaux composés dans la phase de découverte du pipeline de développement de médicaments, où les quantités de composés peuvent être limitées. Des biofilms monospécifiques de P. aeruginosa ont été formés dans un milieu synthétique de fibrose kystique 2 (SCFM2) pendant 24 h avant d’être traités avec du méropénème à différentes concentrations (1, 16 et 256 μg/mL) pendant 24 h supplémentaires. Des biofilms polymicrobiens ont été établis en cultivant Staphylococcus aureus et Candida albicans ensemble dans SCFM2, puis en inoculant avec P. aeruginosa pendant 24 heures supplémentaires et en traitant avec du méropénème. L’absence de lien direct entre les mesures d’efficacité des composés dans les essais précliniques et les résultats des essais cliniques a jeté un doute sur l’applicabilité des outils de dépistage en laboratoire actuels. Ce modèle nous permet de comprendre l’impact des facteurs pertinents sur l’expression des gènes de P. aeruginosa, y compris les gènes contribuant à la résistance et à la virulence, comblant ainsi cet écart.

Les résultats présentés dans Figure 1A mettre en évidence la résilience de l'espèce unique Pseudomonas des biofilms lorsqu'ils sont soumis à un traitement par la méropénème, aucune diminution significative n'ayant été observée à aucune des doses testées. Le témoin négatif, non exposé à la méropénème, a montré une récupération de 8,31 ± 0,07 Log10UFC/mL, tandis que la plus grande réduction du nombre de cellules viables a eu lieu à 16 µg/mL, ce qui donne un rendement de 8,06 ± 0,10 Log10UFC/mL. Toutefois, ce niveau de résistance est attendu, car il est indiqué dans la littérature que P. aeruginosa les biofilms sont beaucoup plus résistants au méropénème que leurs homologues planctoniques, la concentration nécessaire &gt;256 µg/mL d'être bactéricide contre les biofilms25,26, par rapport aux cellules planctoniques, qui présentent une CMI de 2 µg/mL.
Figure 1B montre le pourcentage moyen de réduction de l'activité métabolique des biofilms de P. aeruginosa en monoculture à chaque concentration d'antibiotique par rapport au biofilm témoin, qui n'a pas été exposé au méropénème. Une diminution de la fluorescence correspond à une activité métabolique réduite, considérée comme un indicateur de la diminution du nombre de cellules viables. Les cultures traitées au méropénème ont montré une augmentation de l'activité métabolique (indiquée par une réduction en pourcentage négative), suggérant une absence (ou une très faible) activité bactéricide.
L'activité métabolique accrue sans augmentation du nombre de CFU récupérés pourrait indiquer la réponse métabolique des bactéries à l'exposition aux antibiotiques. Entre les biofilms monospécifiques et les biofilms multispcifiques (Figure 2), la croissance globale de P. aeruginosa ne différait que légèrement, la récupération de cellules viables à partir du biofilm monospécifique étant supérieure de 0,74 ± 0,17 Log10CFU/mL à celle observée dans le biofilm polymicrobien en l'absence d'antibiotique. S. aureus a été récupéré à partir du biofilm polymicrobien à 6,95 ± 0,11 Log10CFU/mL, et C. albicans a été récupéré à 1,66 ± 2,88 Log10CFU/mL. C. albicans, toutefois, n'est présent que là où aucun méropénème n'a été ajouté et n'a été récupéré dans aucun biofilm auquel l'antibiotique avait été administré. Étant donné que le méropénème n'a aucun effet direct sur Candida, comme cela a été démontré lors d'essais CMI antérieurs réalisés en laboratoire sur une monoculture de C. albicans, où la valeur de CMI du méropénème était &gt;256 µg/mL, il est probable que ce soit la réponse au stress bactérien des autres espèces cohabitantes, S. aureus et P. aeruginosa, à l'exposition à l'antibiotique qui crée des conditions hostiles pour le champignon.
Étant donné que les biofilms de P. aeruginosa, en monoculture ou en présence de pathogènes co-colonisateurs, ne montrent aucune réduction de la récupération de cellules viables en présence de concentrations de mérépénème allant jusqu'à 256 µg/mL, cela souligne la nécessité de thérapeutiques alternatives, telles que les thérapies anti-virulence, pour lutter contre ces infections chroniques en milieu clinique, qui pourraient agir en synergie avec les antimicrobiens afin de réduire efficacement la charge bactérienne.
algD expression dans des biofilms monospécifiques de P. aeruginosa PAO1 
L'expression de algD dans P. aeruginosa PAO1 exposé à différentes concentrations de m&eacute;rop&eacute;n&egrave;me (1, 16 et 256 &micro;g/mL) cultiv&eacute; dans du SCFM2 a &eacute;t&eacute; &eacute;valu&eacute;e par RT-qPCR avec le colorant SYBR-Green. L'expression a ensuite &eacute;t&eacute; analys&eacute;e selon la m&eacute;thode 2-ΔΔCt, en utilisant 16S comme g&egrave;ne t&eacute;moin (Figure 3). L'expression de algD ne pr&eacute;sentait pas de diff&eacute;rence significative entre les concentrations de m&eacute;rop&eacute;n&egrave;me utilis&eacute;es, ce qui sugg&egrave;re que, lorsqu'il est cultiv&eacute; en biofilm monosp&eacute;cifique, l'expression de algD dans PAO1 n'est pas fortement influenc&eacute;e par la pr&eacute;sence de m&eacute;rop&eacute;n&egrave;me.
algD expression dans des biofilms multi-espèces de P. aeruginosa PAO1 
L'expression de algD a également été évaluée chez P. aeruginosa PAO1 cultivé dans des biofilms composés de S. aureus SH100 et de C. albicans CAF2.1, afin d'évaluer si la présence d'organismes co-colonisants influençait l'expression de algD ou la réponse au méropénème chez PAO1. Aucune différence significative de l'expression de algD n'a été observée entre les concentrations de 0 à 16 µg/mL de méropénème. Toutefois, à 256 µg/mL, l'expression de algD était significativement plus élevée par rapport aux autres concentrations d'antibiotique (0 µg/mL contre 256 µg/mL, p = 0,0075 ; 1 µg/mL contre 256 µg/mL, p = 0,035 ; 16 µg/mL contre 256 µg/mL, p = 0,0048), environ 7 fois supérieure à celle de la condition témoin (Figure 4). Cela montre que, lorsqu'il est cultivé en présence de S. aureus et de C. albicans, P. aeruginosa présente une expression accrue de algD à la concentration la plus élevée de méropénème, par comparaison avec sa culture en monoculture, suggérant une augmentation de la production d'alginate dans un contexte polymicrobien. Bien que des différences d'expression de algD aient été mises en évidence entre les biofilms mono- et multi-espèces, il n'est pas clair si cette augmentation d'expression est induite par la présence d'une espèce spécifique (S. aureus ou C. albicans) ou si des interactions impliquant les deux micro-organismes sont responsables de cette modulation de l'expression génique.
Ces résultats soulignent l'importance de comprendre l'impact des thérapeutiques et de l'environnement sur l'expression des gènes, particulièrement dans le contexte des futurs tests de thérapeutiques ciblant la virulence.
<img alt="Graphiques en barres de l'inhibition de la croissance bactérienne pour P. aeruginosa, S. aureus et C. albicans en fonction de la concentration." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Biofilms monospécifiques composés de Pseudomonas aeruginosa PAO1. Les biofilms ont été cultivés pendant 24 h dans du SCFM2, traités avec 50 µg/mL de DNase I pendant 1 h, puis exposés à des concentrations variables de méropénème pendant 24 h supplémentaires. (A) Log10 moyen de l'UFC/mL. La ligne pointillée indique une réduction de 2 log (équivalente à une réduction de 99 %) de la récupération de P. aeruginosa par rapport au témoin négatif. (B) Pourcentage de réduction des unités de fluorescence relative. La ligne pointillée indique une réduction de 50 % de la fluorescence ; le premier point au-dessus de cette valeur est considéré comme la valeur de CMI50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Concentration de méropénème par rapport à la croissance bactérienne (A) et à la réduction de la fluorescence (B) sur les graphiques." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Biofilms multi-espèces composés de Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 et Candida albicans CAF2.1. Les biofilms ont été cultivés pendant 24 h dans du SCFM2, traités avec 50 µg/mL de DNase I pendant 1 h, puis exposés à différentes concentrations de méropénème pendant 24 h supplémentaires. La ligne pointillée indique une réduction de 2 log (équivalente à une réduction de 99 %) de la récupération de P. aeruginosa par rapport au témoin négatif. La significativité a été déterminée par une ANOVA à deux facteurs, où **** p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphique en barres de l'expression relative en fonction de la concentration (µg/ml), montrant le résultat de l'analyse statistique (ns)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3: Expression de algD extraite d'une espèce unique composée de P. aeruginosa PAO1. Les biofilms ont été cultivés pendant 24 h dans du SCFM2, traités avec 50 µg/mL d'ADNase I pendant 1 h, puis exposés à différentes concentrations de méropénème (0, 1, 16, 256 µg/mL). L'expression génique a été analysée selon la méthode 2-ΔΔCt. Le gène d'entretien 16S a été utilisé dans l'analyse. La significativité a été déterminée par le test de comparaison multiple de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Histogramme de l'expression relative en fonction de la concentration ; signification statistique ; analyse de l'expression génique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4 : Expression de algD extraite de biofilms multi-espèces composés de P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 et C. albicans CAF2.1. Les biofilms ont été cultivés dans du SCFM2, traités avec 50 µg/mL de DNase I pendant 1 h, puis exposés à du méropénème à différentes concentrations (0, 1, 16, 256 µg/mL) pendant 24 h supplémentaires. L'expression génique a été analysée selon la méthode 2-ΔΔCt. Le gène de référence 16S a été utilisé dans l'analyse. **p &lt; 0,01 déterminé par le test de comparaison multiple de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Volume par réaction de synthèse d'ADNc (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X iscript Reaction mix</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iscript Reverse Transcriptase</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eau sans DNase/ni RNase</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5 ng d'ARN</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume total de la réaction</td>
			<td>20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Solutions de travail du mélange maître d'ADNc. Composants et volumes requis par réaction d'ADNc.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gène</td>
			<td>Amorce directe</td>
			<td>Amorce inverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>algD</td>
			<td>CGCCGAGATGATCAAGTACA</td>
			<td>TGTAGTAGCGCGACAGGTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16S</td>
			<td>ACCGCATACGTCCTACGG</td>
			<td>CGAAGACCTTCTTCACACACG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : algD et amorces sens et antisens de qPCR pour 16S.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Volume par réaction (µL)</td>
			<td>Volume de travail d'algD (µL)</td>
			<td>Volume de travail de 16S (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>10</td>
			<td>440</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amorce sens</td>
			<td>1</td>
			<td>44</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amorce antisens</td>
			<td>1</td>
			<td>44</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eau sans DNase/ni RNase</td>
			<td>6</td>
			<td>264</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total </td>
			<td>18</td>
			<td>792</td>
			<td>72</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 3 : Solutions de travail du mélange maître de qPCR. Composants et volumes nécessaires pour les solutions de mélange maître de qPCR pour algD et 16S.
Figure supplémentaire 1 : Biofilms multi-espèces composés de Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 et Candida albicans CAF2.1. Les biofilms ont été cultivés pendant 24 h (n = 3) dans du SCFM2, traités avec 50 µg/mL de DNase I pendant 1 h, puis exposés à des concentrations variables de méropénème pendant 24 h supplémentaires. La ligne pointillée indique une réduction de 2 log (équivalente à une réduction de 99 %) du nombre de colonies de P. aeruginosa par rapport au témoin négatif. Une analyse statistique a été réalisée par ANOVA à deux facteurs. *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p &lt;0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/Supplementary_Figure_1_RE.tif" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.</a>

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Modèle de biofilm agrégé de fibrose kystique pour étudier l’expression génique liée à l’infection

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not ...

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