Name: Visualisation de la sialylation intracellulaire avec la chimie clic et la microscopie à expansion (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Découvrez une méthode de visualisation des glycoconjugués sialylés intracellulaires par chimie clic et microscopie à expansion. Cette technique améliore la résolution spatiale sans équipement super-résolution coûteux.

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<meta charset="utf8"></head><body>Microscopie à expansion pour la visualisation de glycanes sialylés intracellulaires via MOE

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Le protocole actuel de marquage CuAAC n’inclut pas l’aminoguanidine dans le tampon de réaction. Puisqu’il vise à visualiser les glycoconjugués intracellulaires, il est réalisé sur des cellules qui sont fixées après l’étape d’incorporation métabolique, afin d’éviter tout problème de cytotoxicité et d’améliorer l’absorption du système catalytique. L’utilisation de l’aminoguanidine est généralement recommandée pour le marquage de la surface cellulaire des cellules vivantes afin de prévenir les réactions secondaires entre le...

La microscopie à fluorescence, bien que largement utilisée pour le marquage et la visualisation de molécules spécifiques dans les cellules, est intrinsèquement limitée en résolution par la limite de diffraction de la lumière1 d’Abbe, qui limite la capacité de distinguer les objets situés à moins de 200-250 nm environ. Cette limitation provient de la nature ondulatoire de la lumière et de l’ouverture numérique de la lentille de l’objectif du microscope, ce qui pose un défi lors de l’imagerie des structures subcellulaires. Le dépassement de ces limites permet de mieux comprendre certains processus biologiques à l’échelle nanométrique.
Pour dépasser la limite de diffraction de la lumière, des techniques de microscopie à super-résolution telles que STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) et STED (Stimulated Emission Depletion) ont été développées 2,3. STORM repose sur l’activation stochastique des fluorophores, ne permettant d’imager qu’un sous-ensemble clairsemé à un moment donné. Cela permet de localiser avec précision les fluorophores individuels, ce qui permet la reconstruction d’une image à haute résolution. STED, quant à lui, améliore la résolution en utilisant un laser d’appauvrissement pour éteindre sélectivement la fluorescence autour de la périphérie du point d’excitation, réduisant ainsi efficacement la fonction d’étalement du point.
Ces approches contrastent avec la microscopie à champ large ou confocale, où tous les fluorophores sont détectés simultanément, ce qui donne une image qui combine tous les motifs de diffraction et empêche la distinction entre les fluorophores individuels proches, entraînant une perte de résolution. Cependant, ces méthodes de super-résolution nécessitent des sources lumineuses, des équipements, une préparation d’échantillons et/ou des fluorophores très spécifiques, ce qui rend ces technologies coûteuses, difficiles d’accès dans la plupart des laboratoires et difficiles à mettre en œuvre dans les expériences de routine. Ces contraintes ont conduit la communauté scientifique à rechercher des solutions alternatives pour obtenir une résolution plus élevée, qui seraient compatibles avec les équipements de microscopie facilement disponibles et les protocoles de coloration de routine. En 2015, Boyden et ses collègues ont mis au point une méthode permettant de contourner les limites de la microscopie optique en élargissant physiquement l’échantillon, appelée microscopie d’expansion (ExM)4.
ExM est une méthode en trois étapes qui fournit des détails à l’échelle nanométrique d’échantillons biologiques sans dépasser la limite de diffraction de la lumière (Figure 1). Au lieu de cela, il utilise des microscopes conventionnels limités par la diffraction pour imager des échantillons qui ont été physiquement agrandis de manière isotrope. La première étape, appelée gélification, consiste à intégrer l’échantillon biologique, généralement des cellules ou des tissus fixés, dans un hydrogel polyélectrolytique gonflant à base d’acrylate de sodium et d’acrylamide. L’échantillon biologique subit ensuite un traitement enzymatique pour dégrader partiellement certains composants tels que les protéines ou les membranes, et décomposer les structures cellulaires denses pour garantir l’expansion uniforme des cellules. Cette étape, appelée digestion, permet d’y parvenir en homogénéisant les composants structurels de l’échantillon en ce qui concerne les propriétés mécaniques, empêchant ainsi l’expansion différentielle qui pourrait entraîner une distorsion de l’échantillon. Enfin, dans la dernière étape, appelée expansion, l’échantillon enrobé d’hydrogel et digéré est placé dans de l’eau désionisée, ce qui le fait gonfler. Cette technologie permet à l’échantillon d’augmenter d’un facteur de grossissement linéaire d’environ 4 à 5x dans toutes les dimensions, ce qui permet de visualiser de fins détails cellulaires à l’aide de techniques de microscopie standard. Compte tenu de la nature isotrope de l’expansion, l’échantillon biologique agrandi à l’intérieur de la matrice de gel conserve ses détails géométriques tridimensionnels et les relations spatiales entre ses différents composants structurels. L’information spatiale est donc préservée lors du gonflement, tandis que la distance entre les marqueurs fluorescents ancrés dans le gel ou les biomolécules augmente uniformément dans toutes les directions. Cela permet une meilleure séparation des signaux, ce qui se traduit par une résolution améliorée.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig01.jpg"> 
Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole ExM. (a) Gélification : L’échantillon biologique est ancré et noyé dans un hydrogel polyélectrolytique gonflant. b) Digestion : Les propriétés mécaniques de l’échantillon sont homogénéisées par l’utilisation d’enzymes et de détergents, décomposant les protéines et les membranes lipidiques qui, autrement, limiteraient l’expansion et créeraient des distorsions. (c) Expansion : L’hydrogel est immergé dans de l’eau déminéralisée, ce qui provoque une expansion isotrope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Depuis 2015, ExM a constaté d’importantes améliorations technologiques dans la préservation de l’information spatiale. En particulier, divers ancrages moléculaires ont été conçus pour fixer de manière covalente des biomolécules directement sur l’hydrogel gonflant 5,6. Dans ce protocole, nous avons utilisé le N-acryloxysuccinimide (NAS), qui réagit avec les groupes amines libres des biomolécules (généralement, les résidus de lysine ou les positions N-terminales des protéines) pour bioconjuguer un groupe acryloyle aux protéines de la cellule, y compris les glycoprotéines. Ce groupe acryloyle réagit ensuite avec d’autres monomères par des réactions de réticulation pendant la gélification, ancrant ces biomolécules directement au polymère.
ExM est compatible avec un large éventail de méthodes de marquage, y compris l’ingénierie métabolique des oligosaccharides (MOE). MOE est un outil puissant qui permet le marquage des glycanes en incorporant des analogues de précurseurs métaboliques équipés d’une poignée chimique bioorthogonale7. Ces analogues, connus sous le nom de rapporteurs chimiques, s’intègrent dans les voies métaboliques sans provoquer de toxicité. Dans l’approche MOE, les monosaccharides rapporteurs sont métaboliquement transformés en sucres nucléotidiques activés, puis transférés dans des glycoconjugués naissants. Nous nous concentrons principalement sur l’étude de la sialylation, en particulier la dynamique intracellulaire et le trafic des N-glycoprotéines sialylées, qui sont cruciales dans le contexte de la santé et de la maladie en raison de leur rôle dans les interactions cellule-cellule, la régulation immunitaire et le développement. La sialylation anormale est impliquée dans des maladies telles que le cancer 8,9,10,11, les maladies infectieuses12 et les troubles génétiques 13,14,15, ce qui en fait une cible clé pour le développement thérapeutique et la découverte de biomarqueurs. La compréhension de la sialylation permet de mieux comprendre la glycobiologie et les mécanismes de la maladie.
La sialylation peut être sondée à l’aide de MOE avec des analogues de l’acide N-acétylneuraminique (Neu5Ac), l’acide sialique le plus abondant chez l’homme, ou avec des analogues de la N-acétylmannosamine (ManNAc), un précurseur métabolique de Neu5Ac, portant une poignée bioorthogonale 8,16. Le ManNAc est converti en Neu5Ac dans le cytosol, puis activé en acide cytidine-5'-monophospho-N-neuraminique (CMP-Neu5Ac) dans le noyau. Une fois activées en sucre nucléotidique, les sialyltransférases dans l’appareil de Golgi transfèrent les unités Neu5Ac aux positions terminales des chaînes de glycanes en croissance (Figure 2). Suite à l’incorporation métabolique de dérivés non naturels de ManNAc, les glycanes sialylés marqués peuvent être liés de manière covalente à un fluorophore portant un groupe réactif complémentaire à la poignée rapporteure par chimie clic bioorthogonale. Cela permet l’observation directe des glycoconjugués in vivo ou ex vivo.
Pour la plupart des rapporteurs monosaccharides, une forme peracétylée est nécessaire pour traverser la membrane plasmique par diffusion passive. Cependant, il a été démontré que les rapporteurs peracétylés et non protégés sondent efficacement la sialylation16. Les rapporteurs de sialylation non protégés sont capables de pénétrer dans les cellules par des mécanismes de transport actifs, à savoir la pinocytose pour les analogues de Neu5Ac, et un transporteur encore non identifié pour ManNAc. Alors que les sucres non protégés nécessitent une concentration plus élevée (généralement 100-500 μM) pour obtenir des effets comparables, une fois à l’intérieur de la cellule, ils peuvent entrer directement dans la voie métabolique de l’acide sialique. En revanche, les sucres peracétylés doivent être entièrement désacétylés par des estérases non spécifiques intracellulaires avant de devenir métaboliquement actifs. Bien qu’ils puissent être utilisés à des concentrations plus faibles (généralement de 10 à 50 μM), une désacétylation incomplète peut interférer avec l’activité enzymatique ou conduire à l’incorporation d’analogues de l’acide sialique partiellement acétylés, ce qui peut fausser l’analyse en aval. De plus, la libération d’acide acétique peut affecter le pH localement, ce qui peut avoir un impact sur la fonction cellulaire. Chen et ses collègues ont également démontré que les sucres per-O-acétylés réagissent avec les résidus de cystéine libres dans les protéines via un mécanisme non enzymatique, conduisant à une incorporation hors cible et à une augmentation du signal non spécifique17,18. Dans le présent protocole, nous employons donc des reporters non protégés.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig02.jpg"> 
Figure 2 : Ingénierie des oligosaccharides métaboliques et marquage des acides sialiques. UDP-GlcNAc est converti en ManNAc par le domaine UDP-GlcNAc 2-épimérase de GNE/MNK dans le cytosol. Le ManNAc est ensuite phosphorylé dans le cytosol par le domaine ManNAc 6-kinase de GNE/MNK pour former du ManNAc-6-phosphate. La N-acétylneuraminate synthase catalyse la condensation du ManNAc-6-P avec le phosphoénolpyruvate pour produire le Neu5Ac-9-phosphate, qui est ensuite déphosphorylé par la phosphatase de l’acide sialique pour produire le Neu5Ac. Neu5Ac peut également être fourni par la voie de récupération via l’endocytose et le recyclage lysosomal8. Après avoir été transporté vers le noyau, il est converti en CMP-Neu5Ac par la CMP-synthétase d’acide sialique. Dans l’appareil de Golgi, CMP-NeuAc est le substrat des sialyltransférases qui introduisent une fraction Neu5Ac aux positions terminales des glycanes sur les glycoconjugués en maturation, qui sont finalement exprimés au niveau de la membrane cellulaire ou sécrétés. Les rapporteurs chimiques ManNAz portant une poignée bioorthogonale peuvent pénétrer dans la cellule par le biais d’un transporteur actif non identifié et entrer dans la voie métabolique. Les unités Neu5Az marquées incorporées dans les glycanes après biosynthèse sont ensuite marquées par conjugaison médiée par CuAAC d’une sonde fluorescente. Abréviations : NAc = N-acétyle ; UDP-GlcNAc = N-acétylglucosamine de diphosphate d’uridine ; ManNAc = N-acétylmannosamine ; GNE = UDP-GlcNAc 2-épimérase ; MNK = ManNAc 6-kinase ; ManNAc-6-P = ManNAc-6-phosphate ; NANS = N-acétylneuraminate synthase ; PEP = phosphoénolpyruvate ; Neu5Ac = acide N-acétylneuraminique ; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-phosphate ; NANP = phosphatase d’acide sialique ; CMP = cytidine-5′-monophosphate ; CMAS = CMP-acide sialique synthétase ; ST = sialyltransférases ; ManNAz = N-azidoacétylmannosamine ; Neu5Az = acide N-azidoacétylneuraminique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Parmi les réactions bioorthogonales possibles, nous nous sommes intéressés à la cycloaddition d’azoture-alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC)16,19. D’après notre expérience, CuAAC est la meilleure option pour marquer les glycanes intracellulaires dans les cellules fixes. Cette réaction est bien établie, étudiée en profondeur en chimie bioorthogonale, et a été normalisée pour une utilisation dans des environnements biologiques complexes, fournissant une base solide de connaissances et des protocoles optimisés. Sa cinétique rapide offre en effet une efficacité de réaction et une spécificité élevées, et il implique des groupes azides et alcynes faciles à synthétiser, stables, absents des systèmes vivants et inertes vis-à-vis des biomolécules natives, ce qui le rend idéal pour les applications à cellules fixes où la toxicité du cuivre n’est pas un problème. La cycloaddition d’alcyne-azoture (SPAAC)20,21, tout en évitant la toxicité du cuivre, a une cinétique plus lente et des sondes plus volumineuses, ce qui tend à conduire à un signal de fond plus élevé et à une diminution du rapport signal/bruit pour les applications intracellulaires en raison du piégeage hydrophobe, tandis que l’IEDDA (IEDDA)22,23, bien que rapide et sans cuivre, implique une synthèse de sonde plus complexe et nécessite des groupes rapporteurs plus volumineux qui n’ont pas encore été entièrement caractérisés dans les applications MOE. Étant donné que l’ExM nécessite exclusivement des cellules fixes, CuAAC offre une solution robuste et efficace pour le marquage bioorthogonal.
Cet article présente un protocole pour la visualisation des glycoprotéines sialylées intracellulaires dans les cellules, combinant le marquage métabolique, la chimie clic bioorthogonale et la microscopie à expansion. Dans les procédures expérimentales décrites dans cet article, nous utilisons la N-azidoacétylmannosamine (ManNAz) comme rapporteur chimique, et la ligature CuAAC de petits fluorophores organiques est effectuée avant la procédure d’expansion. Les glycoprotéines sont ancrées à l’hydrogel avec des NAS avant la gélification, la digestion et l’expansion. Le marquage MOE des acides sialiques peut être associé à des approches d’immunofluorescence pour l’évaluation de la co-localisation, comme illustré ici avec un anticorps primaire anti-GM130 de souris localisé dans l’appareil cis-Golgi. Ce protocole peut être appliqué à des cellules dans leur état physiologique, ou à des cellules qui ont été soumises à un traitement chimique. Pour illustrer cela, la chloroquine a été utilisée pour inhiber la fonction lysosomale, qui affecte le traitement et le trafic des glycoprotéines dans les cellules. La coloration nucléaire est utilisée comme point de repère, non seulement pour localiser les cellules, mais aussi comme indicateur de la qualité du processus ExM. Le facteur d’expansion peut en effet être mesuré en comparant la taille du noyau de pré-expansion (preExM) et de post-expansion (postExM).

<table><tbody><tr><td>(+) L-ascorbate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 12 puits</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>Acide acrylique N-hydroxysuccinimide ester&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8060</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 alcyne&nbsp ;</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1277-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 chèvre anti-souris IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9913</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrylamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BTTAA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-067-100</td><td></td></tr><tr><td>Tube de centrifugation 2 mL</td><td>EPPENDORF</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Sel de diphosphate de chloroquine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>lamelles 12 mm #1</td><td>epredia</td><td>CB00120RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>lamelles 32 mm #1</td><td>epredia</td><td>CB00320RA140MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMEM milieu à haute teneur en glucose&nbsp ;</td><td>Dutscher</td><td>L0104-500</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS)&nbsp ;</td><td>Dutscher</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblaste 533T</td><td>-</td><td>-</td><td>Recueilli sur un individu sain</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.9.0</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Bio-RAD</td><td>170-6537</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50950</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.2</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Euromedex</td><td>PB0447-B</td><td>Microscopie confocale anhydre</td></tr><tr><td>LSM 780&nbsp ;</td><td></td><td>Zeiss-MCF7</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylmannosamine (ManNAc)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA05269</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td></td></tr><tr><td>N-azidoacetylmannosamine (ManNAz)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA46002</td><td></td></tr><tr><td>Objectif « Plan-Apochromat » 63x/1,4 Huile DIC M27</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-799&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>à partir de&nbsp ; Tritirachium album</td></tr><tr><td>souris purifiée GM130 anticorps</td><td>BD Bioscience</td><td>610822</td><td>50 &micro ; g</td></tr><tr><td>Acrylate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408220</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flacon</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>tris Acétate EDTA (TAE) 10x</td><td>Euromedex</td><td>EU0202-B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Bleu</td><td>Dutscher</td><td>702630</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 1x</td><td>Dutscher</td><td>N° L0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de la sialylation intracellulaire avec la chimie clic et la microscopie à expansion

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

L’application du protocole pour visualiser les glycoprotéines sialylées dans les cellules HeLa (Figure 3A) et les cellules MCF7 (Figure 3B), en omettant le traitement CQ (section 2 du protocole) et la coloration de co-localisation par immunofluorescence (étape 5.3 du protocole).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig03.jpg"> 
Figure 3...

Visualisation de la sialylation intracellulaire avec la chimie clic et la microscopie à expansion

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

visualizing-intracellular-sialylation-with-click-chemistry-expansion

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