Génération de sphéroïdes à partir de divers chondrocytes à l’aide de conditions à faible adhérence sous gravité et de mini-bioréacteurs faits maison

La réparation du cartilage dans les maladies articulaires chroniques nécessite des thérapies cellulaires avancées pour régénérer efficacement les tissus endommagés. Ce protocole fournit une méthode étape par étape pour différencier les cellules souches pluripotentes induites en sphéroïdes à base de chondrocytes, soutenant ainsi les applications d’ingénierie tissulaire et de thérapie cellulaire. La réparation du cartilage dans les maladies articulaires chroniques nécessite des thérapies cellulaires avancées pour régénérer suffisamment les tissus endommagés.

Ce protocole fournit une méthode étape par étape pour différencier les cellules souches pluripotentes induites en sphéroïdes à base de chondrocytes, soutenant ainsi les applications d’ingénierie tissulaire et de thérapie cellulaire. Les principaux défis sont de minimiser l’expression du collagène de type 1 dans les cellules dérivées d’iPSC afin de prévenir le cartilage fibreux, de créer des conditions propices à la formation de cartilage mature en haute ligne, d’améliorer les méthodes de culture 3D pour la stabilité des sphéroïdes et de développer des approches évolutives pour produire des volumes cliniques de matériel cellulaire. Le protocole offre un avantage en utilisant les iPSC comme source alternative de chondrocytes, permettant une production évolutive sans procédures invasives.

Il assure un meilleur maintien du phénotype des chondrocytes grâce à la culture 3D et imite le développement naturel du cartilage, ce qui permet d’obtenir des cellules ressemblant étroitement aux chondrocytes natifs avec une forte expression de marqueurs spécifiques du cartilage. Développer des méthodes efficaces pour améliorer la maturité et la fonctionnalité des chondrocytes dérivés d’iPSC, assurer la stabilité à long terme in vivo, créer des matériaux de culture tridimensionnels fibrosés et développer une production évolutive de matériel cellulaire pour une application clinique. Pour commencer, stérilisez les ciseaux dans un autoclave réglé à 121 degrés Celsius à 15 livres par pouce carré pendant 30 minutes.

Une fois les ciseaux secs, coupez les tubes à centrifuger en anneaux de sept à huit millimètres de hauteur. Maintenant, écrasez les boîtes de Pétri à faible adhérence, non traitées ou microbiologiques en petits morceaux à l’aide d’un outil de broyage approprié. Dissoudre environ un gramme de particules de plastique dans 10 millilitres de chloroforme pendant la nuit à l’intérieur d’une hotte.

Vérifiez la viscosité de la solution plastique liquide pour vous assurer qu’elle convient au pipetage. Si la solution est trop liquide, ajoutez un à trois grammes de particules de plastique supplémentaires. S’il devient trop épais, diluez-le avec environ cinq millilitres de chloroforme.

Placez un anneau en plastique autoclave au centre d’une boîte de Pétri de 60 millimètres. Appliquez ensuite du plastique liquide à l’intérieur de l’anneau pour former un bouton en plastique. Laissez sécher la vaisselle à découvert dans une hotte à flux laminaire pendant deux à trois heures.

Après séchage, exposez la vaisselle aux rayons ultraviolets pendant 20 à 30 minutes. Pour commencer, procurez-vous les boîtes de Pétri modifiées contenant des boutons en plastique. Deux jours après le prélèvement du cartilage, lavez les morceaux de cartilage dans la solution de Hank à l’aide de boîtes de Pétri de 60 millimètres.

Ensuite, coupez le cartilage en fragments d’environ un à deux millimètres de diamètre à l’aide de ciseaux autoclave. Transférez les morceaux de cartilage dans un tube de 15 millilitres et digérez-les dans une solution de collagénase de type deux à 0,01 % dans du DMEM pendant huit à 12 heures dans un incubateur à agitateur orbital. Après la digestion, ajoutez les fragments de cartilage avec du DMEM et centrifugez le tube à 300 G pendant 10 minutes.

Après avoir jeté la solution de lavage, remettre les fragments en suspension dans un milieu de culture de chondrocytes et les semer dans une fiole adhésive T25 pré-enduite d’une solution de gélatine à 0,1 % et incuber. Ensuite, cultivez des cellules souches pluripotentes induites dans des plaques à six puits pré-recouvertes d’une matrice contenant des protéines extracellulaires. Pour initier la différenciation vers la lignée chondrocytaire, cultivez des iPSC dans le milieu A pendant les deux premiers jours.

Le troisième jour, remplacez le milieu A par une solution qui exclut le CHIR-99021 et l’inhibiteur de la rho-kinase tout en gardant tous les autres composants inchangés. Le 10e jour, transférez des cellules de type chondrocytes dans un milieu B formulé pour faciliter la chondrogenèse, puis faites fondre 1,5 % d’argarose au micro-ondes pendant environ 60 à 90 secondes à 700 watts. Une fois liquéfié, ajoutez 75 microlitres d’agarose dans chaque puits d’une plaque de culture en suspension cellulaire de 96 puits et laissez-le durcir à température ambiante.

Ensuite, ajoutez 150 microlitres de DMEM dans chaque puits et incubez la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant au moins 12 heures. Le jour 12, observez les changements phénotypiques associés à l’androgenèse pour procéder à l’initiation des sphéroïdes. Détachez les cellules à 80 % de confluence de la plaque à l’aide d’une solution de trypsine à 0,05 %.

Après avoir ajouté des volumes égaux de DMEM avec 10 % de FBS, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 200 G pendant cinq minutes. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu B et transférez-les dans un flacon de culture cellulaire de 75 centimètres carrés pré-enduit d’une solution de gélatine à 0,1 %. Une fois que les cellules atteignent 80 % de confluence en tant que monocouche, détachez-les à nouveau avec de la trypsine et rémettez-les en suspension dans le milieu B.Distribuez maintenant les cellules dans une plaque de 96 puits recouverte de 1,5 % d’agarose à une densité de 100 000 cellules par puits, avec 150 microlitres de milieu B.Incuber les cellules pendant un minimum d’un jour et un maximum de trois jours jusqu’à ce que les sphéroïdes se forment.

Transférez ensuite les sphéroïdes des puits à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre avec une extrémité coupée dans un tube de 15 millilitres. Laissez les sphéroïdes se déposer pendant deux à trois minutes et retirez le surnageant. Plongez maintenant les sphéroïdes dans une solution de matrice de membrane basale fraîchement décongelée et non diluée tempérée à quatre degrés Celsius.

Après 30 minutes, centrifugez le tube à 100 G pendant une minute pour recueillir les sphéroïdes. Enfin, transférez les sphéroïdes dans les mini-bioréacteurs préparés et ajoutez six millilitres de milieu B.Placez le mini-bioréacteur dans un incubateur de dioxyde de carbone. Après 19 jours de différenciation, 99 % des cellules ont exprimé des marqueurs chondrogéniques aggrécan, collagène de type un, collagène de type deux et SOX9.

Les chondrosphères de haute qualité ont été identifiées comme celles présentant au moins 90 à 95 % d’expression de marqueurs génétiques chondrocytaires, évaluées par analyse de l’expression génique au 30e jour de différenciation. Les sphéroïdes matures ont présenté une morphogenèse constante, atteignant un diamètre typique d’un à deux millimètres après deux mois, tandis que les sphéroïdes plus grands présentaient des zones centrales avec des caries ou une nécrose.