Name: Génération de sphéroïdes à partir de divers chondrocytes à l’aide de conditions à faible adhérence sous gravité et de mini-bioréacteurs faits maison (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Découvrez la génération de sphéroïdes chondrocytaires à partir de cellules iPSCs pour la réparation du cartilage. Cette méthode utilise des mini-bioréacteurs et des conditions de faible adhérence.

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L’étude a été examinée et approuvée par le Comité d’éthique du LOPUKHIN FRCC PCM (protocole n° 2019/02 du 9 avril 2019). Tous les échantillons prélevés par le donneur ont été prélevés conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants et/ou de leurs tuteurs légaux.
REMARQUE : Maintenez la technique stérile tout au long du protocole. Réchauffez tous les milieux de culture et les solutions à 37 °C avant de les appliquer sur des cellules ou des sphéroïdes. Cultivez des cellules dans un incubateur de CO2 à 37 °C, avec 5 % de CO2 à 80 % d’humidité. Le schéma de protocole est illustré à la figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67481/67481fig1.jpg"> 
Figure 1 : Protocole de production de chondrosphères à partir de la lignée IPSRG4S d’iPSC. (A) Initialement, les iPSC sont cultivées dans des milieux de cellules souches pluripotentes jusqu’à ce que 80 % de confluence soit atteinte. (B) Pour induire la différenciation vers la lignée chondrocytaire, les iPSC sont ensuite cultivées dans le milieu A pendant 2 jours. Le milieu est ensuite remplacé par une formulation dépourvue de Chir 99021 et d’inhibiteur de la Rho kinase, et les cellules sont cultivées pendant 6 jours supplémentaires avec des changements de milieu tous les 2 jours. (C) Les cellules sont ensuite transférées dans le milieu B pour favoriser la chondrogenèse pendant les 10 jours suivants. (D) Une fois qu’un nombre suffisant de cellules est atteint, le processus passe à l’étape de production des sphéroïdes. (E) Les cellules sont agrégées en sphéroïdes dans des conditions de faible adhérence sous l’effet de la gravité. (F) Les sphéroïdes résultants sont cultivés dans des mini-bioréacteurs avec le milieu B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67481/67481fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
1. Transformation de boîtes de Pétri en mini-bioréacteurs
REMARQUE : Détails dans un article précédent5.
<ol>
	<li>Coupez les tubes de centrifugation en anneaux de 7 à 8 mm de haut à l’aide de ciseaux d’autoclave stériles (réglages de l’autoclave : 121 °C (250 °F) à 15 psi, 30 min et séchage post-autoclave pendant 20 min).</li>
	<li>Écrasez les boîtes de Pétri à faible adhérence, non traitées ou microbiologiques en petits morceaux. Dissoudre environ 1 g de particules de plastique dans 10 ml de chloroforme pendant la nuit pour créer une solution plastique liquide. Effectuez cette procédure dans une hotte.</li>
	<li>Vérifiez que le plastique liquide est suffisamment visqueux pour le pipetage. Assurez-vous que les gouttelettes conservent une forme sphérique plutôt que de se propager à la surface. Si la solution est trop liquide, ajoutez plus de particules de plastique, nécessitant généralement 1 à 3 g. S’il est trop épais, ajoutez du chloroforme supplémentaire, nécessitant généralement jusqu’à 5 ml.</li>
	<li>Formez un bouton en plastique au centre d’une boîte de Pétri stérile de 60 mm à très faible adhérence en utilisant l’une des deux méthodes efficaces décrites ci-dessous.<ol>
		<li>Option 1 : Placez l’anneau en plastique autoclavé au centre de la boîte de Pétri, puis appliquez du plastique liquide à l’intérieur de l’anneau ; une goutte nécessitera environ 100 à 200 gouttes de plastique liquide.</li>
		<li>Option 2 : Appliquez le même nombre de gouttes de plastique liquide directement au centre de la boîte de Pétri sans utiliser l’anneau en plastique.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laissez sécher la vaisselle à découvert pendant 2-3 h dans une hotte à flux laminaire. Après séchage, exposez la vaisselle aux rayons ultraviolets pendant 20 à 30 min.</li>
</ol>
2. Traitement des boîtes de culture avec de la gélatine
<ol>
	<li>Préparez une solution de gélatine à 0,1 % en dissolvant la gélatine en poudre dans de l’eau distillée à 95 °C. Passez la solution séquentiellement à travers des filtres à membrane de 0,45 μm et 0,25 μm, puis stockez le filtrat à 4 °C.</li>
	<li>Immédiatement avant le réensemencement des chondrocytes, appliquer les 3 mL de solution de gélatine dans la fiole de 25 cm2 (jusqu’à 15 g de tissu cartilagineux par fiole T25 sont recommandés). Incuber à température ambiante (RT) pendant 30 min, retirer la gélatine, rincer deux fois avec du PBS et procéder à l’ensemencement cellulaire.</li>
</ol>
3. Isolement et culture des chondrocytes
REMARQUE : Les chondrocytes sont isolés dans les régions cartilagineuses non portantes de patients subissant une arthroplastie totale du genou. Prélever tous les échantillons dans des conditions stériles et les conserver dans des tubes stériles remplis de DMEM contenant une solution de pénicilline/streptomycine de 200 U/mL. Conservez le tissu cartilagineux au réfrigérateur à une température de 2 à 8 °C.
<ol>
	<li>Commencer le traitement enzymatique dans les 2 jours suivant le prélèvement du cartilage. Lavez les morceaux de cartilage dans la solution de Hanks à l’aide de boîtes de Pétri de 60 mm, puis coupez le cartilage en fragments d’environ 1 à 2 mm de diamètre à l’aide de ciseaux autoclavés.</li>
	<li>Transférez les morceaux de cartilage dans des tubes de 15 mL et digérez-les dans une solution de collagénase de type II à 0,01 % dans du DMEM, environ 1 mL pour 1 g de cartilage, en 8 à 12 h dans un incubateur de CO2 réglé à 37 °C avec 5 % de CO2, 100 % d’humidité, sous agitation continue sur un agitateur orbital à 150-200 tr/min.</li>
	<li>Après la digestion, laver les fragments de cartilage en ajoutant du DMEM dans un tube de 15 mL, puis centrifuger à 300 × g pendant 10 min. Remettre les fragments en suspension dans un milieu de culture de chondrocytes (tableau supplémentaire 1) et les semer dans une fiole adhésive T25 pré-enduite d’une solution de gélatine à 0,1 %.</li>
	<li>Passage des chondrocytes lorsqu’une densité confluente de 80 % est atteinte.<ol>
		<li>Pour le passage, laver les chondrocytes avec la solution de Hanks, puis incuber les cellules avec une solution de trypsine à 0,25 % à 37 °C pendant 5 min.</li>
		<li>Pour inactiver la trypsine, ajoutez un volume égal de DMEM + 10 % FBS. Remettre les chondrocytes en suspension dans un milieu de culture frais, puis les distribuer dans un rapport de 1:3, en ensemenceant de 20 000 à 30 000 cellules par 1cm2.</li>
		<li>Placez le ballon de culture dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 et 100 % d’humidité.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Culture de cellules souches pluripotentes
REMARQUE : En collaboration avec le Laboratoire de cellules souches du Groupe de recherche moléculaire sur le cerveau, Département de neurobiologie, Institut A.I. Virtanen, Université de Finlande orientale, Kuopio, Finlande, une lignée d’iPSC IPSRG4S, a été générée avec succès dans une étude précédente8.
<ol>
	<li>Cultivez des iPSC dans des plaques à 6 puits pré-enrobées d’une matrice contenant des protéines extracellulaires ( Figure 1A). Utiliser un milieu pour les cellules souches pluripotentes (tableau supplémentaire 1).</li>
	<li>Cellules de passage à 80 % de confluence, en maintenant un rapport de 1:4 (50 000-75 000 cellules par 1cm2). Environ 2 à 3 h avant le détachement, transférer les iPSC dans le milieu pour les cellules souches pluripotentes contenant l’inhibiteur de la Rho kinase Y27632 à une concentration finale de 1 μM pendant 1 jour.</li>
	<li>Laver les iPSC avec la solution de Hanks et incuber à 37 °C avec une solution de trypsine à 0,05 %. Pour inactiver la trypsine, ajoutez un volume égal de DMEM + 10 % FBS. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min dans des tubes de 15 mL.</li>
	<li>Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu frais pour les cellules souches pluripotentes. Pour améliorer la viabilité cellulaire, ajoutez l’inhibiteur de la Rho kinase Y27632 au milieu à une concentration finale de 1 μM pendant 1 jour. Placez la plaque de culture dans un incubateur de CO2 réglé à 37 °C avec 5 % de CO2 et 100 % d’humidité.</li>
</ol>
5. Différenciation chondrogénique des iPSC
<ol>
	<li>Amorcer la différenciation vers la lignée chondrocytaire en cultivant des cellules dans le milieu A (tableau supplémentaire 1) pendant les 2 premiers jours. Le jour 3, remplacez le milieu A par une solution qui exclut le Chir 99021 et l’inhibiteur de la kinase Rho, tout en gardant tous les autres composants inchangés. Changez de milieu tous les 2 jours du 3e au 9e jour (figure 1B).</li>
	<li>Le 10e jour, transférez les cellules de type chondrocytes vers le milieu B (tableau supplémentaire 1), formulé pour faciliter la chondrogenèse. Changez de support tous les 2 jours pendant 10 jours (Figure 1C).</li>
	<li>Préparez à l’avance une plaque de culture en suspension cellulaire de 96 puits en enrobant chaque puits d’agarose à 1,5 % dans de l’eau distillée. Faites fondre l’agarose au micro-ondes jusqu’à ébullition (environ 60-90 s à 700 W). Une fois l’agarose liquéfié, ajouter 75 μL d’agarose dans chaque puits et laisser durcir à RT (environ 15 min).</li>
	<li>Ajouter 150 μL de milieu DMEM dans chaque puits et incuber la plaque dans un incubateur de CO2 pendant au moins 12 h. REMARQUE : Les plaques préparées peuvent être stockées jusqu’à 1 mois dans un incubateur de CO2 à 37 °C si le milieu de chaque puits est réapprovisionné pour compenser l’évaporation.</li>
	<li>Le 12e jour, après avoir observé les changements phénotypiques associés à la chondrogenèse, initier la formation de sphéroïdes à l’aide des cellules de type chondrocytes générées. REMARQUE : À ce stade, il est conseillé d’analyser l’expression des marqueurs chondrocytaires clés par immunocytochimie (ICC) et réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) en utilisant la méthode 2-ΔΔCT 9 pour confirmer la différenciation chondrogénique réussie des iPSC. Lors du passage d’une plaque à 6 puits à une fiole de culture cellulaire de75 cm 2 , une petite partie des cellules peut être ensemencée dans une plaque à 48 puits, correspondant au nombre de marqueurs à analyser. Effectuez une analyse ICC sur ces échantillons pour vérifier l’expression des gènes.</li>
</ol>
6. Formation de sphéroïdes à partir de cellules dérivées d’iPSC de type chondrocytes
<ol>
	<li>Après avoir obtenu des dérivés chondrocytaires, les cellules de passage à 80 % de confluence. Détachez les cellules des plaques à 6 puits à l’aide d’une solution de trypsine à 0,05 %. Pour inactiver la trypsine, ajoutez un volume égal de DMEM + 10 % de FBS, puis transférez les cellules dans un tube de 15 mL et centrifugez à 200 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu B et les transférer dans une fiole de culture cellulaire de75 cm 2 préalablement enduite d’une solution de gélatine à 0,1 % (figure 1D). Une fois que les cellules atteignent 80 % de confluence en tant que monocouche, détachez à nouveau les cellules avec de la trypsine et mettez-les en suspension dans le milieu B comme décrit.</li>
	<li>Transférez les cellules dans une plaque de 96 puits recouverte de 1,5 % d’agarose à une densité de 100 000 cellules par puits. Cultiver dans le milieu B, en ajoutant 150 μL de milieu complet par puits (figures 1D, 3A).</li>
	<li>Maintenir les cellules dans la plaque à 96 puits recouverte d’agarose à 1,5 % pendant au moins 1 jour et au maximum 3 jours jusqu’à ce que des sphéroïdes se forment (figure 2B). Transférez les sphéroïdes des puits à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL avec une extrémité coupée, puis transférez-les dans un tube de 15 mL. Laissez les sphéroïdes se décanter pendant 2-3 minutes et retirez le surnageant.</li>
	<li>Immerger les sphéroïdes dans une solution de matrice de membrane basale fraîchement décongelée et non diluée maintenue à 4 °C. Après 30 min, recueillir les sphéroïdes par sédimentation passive dans un tube de 15 mL ou par centrifugation douce à 100 x g pendant 1 min. REMARQUE : La matrice doit être décongelée pendant la nuit sur de la glace dans un réfrigérateur de 2 à 8 °C. Après le premier dégel, des aliquotes à usage unique de la matrice sont faites pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Des tubes en polypropylène ou d’autres tubes compatibles avec les congélateurs sont utilisés et stockés à -70 °C ou -20 °C. Faites attention à la date d’expiration du lot, qui est de 2 ans à compter de la date de fabrication.</li>
	<li>Transvasez les sphéroïdes dans des mini-bioréacteurs et ajoutez 6 mL de milieu B. Placez le mini-bioréacteur sur un agitateur orbital à l’intérieur d’un incubateur de CO2 réglé à 37 °C avec 5 % de CO2 et 100 % d’humidité et une vitesse d’agitation de 70 à 75 tr/min (figure 1F).</li>
	<li>Changez le milieu chaque semaine ou au besoin par épuisement du milieu ou changement de couleur de l’indicateur acide-base. Pour ce faire, laissez les sphéroïdes se déposer par gravité dans un tube de 15 ml, puis retirez soigneusement le surnageant. Ajoutez du milieu B frais dans le tube et transférez les sphéroïdes dans les mini-bioréacteurs.</li>
</ol>

<ol><li>Cieza, A., Causey, K., Kamenov, K., Hanson, S. W., Chatterji, S., Vos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+the+need+for+rehabilitation+based+on+the+Global+Burden+of+Disease+study+2019%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of Disease study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> Lancet. 396, e10267(2021).</li>
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<li>Castro-Viñuelas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tips+and+tricks+for+successfully+culturing+and+adapting+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 569-581 (2021).</li>
<li>Endo, K., Fujita, N., Nakagawa, T., Nishimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fibroblast+growth+factor-2+and+serum+on+canine+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of fibroblast growth factor-2 and serum on canine mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Tissue Eng Part A. 25 (11-12), 901-910 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Solution de trypsine à 0,05 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Solution de trypsine à 0,25 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 Eagle’s medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal agrégé</td><td>Invitrogen</td><td>AHP0022</td><td>Hôte : souris ; Dilution : 1/500</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td>50 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>de supplément de B-27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>1x ou 2 %</td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>Serva</td><td>28625</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-110-922</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-926</td><td>10 &mu ; M</td></tr><tr><td>COL1A1 (E6A8E) Anticorps monoclonal</td><td>CellSignalling</td><td>39952</td><td>Hôte : Lapin ; Dilution : 1/800</td></tr><tr><td>COL2A1 (M2139) Anticorps monoclonal</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52658</td><td>Hôte : souris ; Dilution : 1/50</td></tr><tr><td>solution de collagénase de type II</td><td>PanEco</td><td>P011-2</td><td>0,01 %</td></tr> <tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td>1 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>de DMEM moyen sans glutamine</td><td>PanEco</td><td> ?420 ?</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>10 %</td></tr><tr><td>La solution de Hanks&nbsp ;</td><td>PanEco</td><td> ?020 ?</td><td></td></tr><tr><td>Hybris 8 medium</td><td>PanEco</td><td> ?780 ?/ ?780</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-Transferrine-Sélénium solution</td><td>PanEco</td><td> ?065</td><td>1x solution a les concentrations suivantes : Insuline : 10 &micro ; g/mL ; Transferrine : 5,5 & micro ; g/mL ; Sélénium 5 ng/mL</td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamine&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD</td><td>354277</td><td>300 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>de solution de pénicilline-streptomycine</td><td>PanEco</td><td> ?063 ?</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-117-339</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la rho kinase Y27632</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-922&nbsp ;</td><td>10 millions d’euros</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire de chèvre anti-Souris IgG (H+L) Adsorbé de manière croisée, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>A21422</td><td>Hôte : Chèvre ; Dilution : 1/500</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire de chèvre anti-Rabbit IgG (H+L) Hautement adsorbé par croisement, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>?32732</td><td>Hôte : Chèvre ; Dilution : 1/500</td></tr><tr><td>Sox9 (D8G8H) Anticorps monoclonal</td><td>CellSignalling</td><td>82630</td><td>Hôte : Rb ; Dilution : 1/400</td></tr><tr><td>TeSR-1 medium</td><td>STEMCELL technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta ; 1&nbsp ;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-095-067</td><td>10 ng/mL</td></tr></tbody></table>

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La réparation du cartilage représente un défi médical non relevé et les approches cellulaires pour concevoir le cartilage articulaire humain sont une solution prometteuse. Ici, nous décrivons les hydrogels biomimétiques tridimensionnels (3D) comme un outil idéal pour l’expansion et la maturation des chondrocytes articulaires humains.

3D hydrogel échafaudages pour articulaire chondrocytes Culture and Cartilage Generation

Le stress mécanique peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches, fournissant une approche thérapeutique potentielle pour la réparation du cartilage altéré. Nous présentons un protocole pour induire la différenciation chondrogénique des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) en utilisant la gravité centrifuge (CG). La régulation positive de SOX9 induite par CG entraîne le développement de phénotypes chondrogéniques.

Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge

Cet article fournit des méthodes détaillées pour fabriquer et caractériser un dispositif microfluidique pneumatiquement actionnant pour la compression de chondrocyte.

Une plate-forme microfluidique pour stimuler les chondrocytes avec compression dynamique

Nous présentons un dispositif microfluidique centrifuge à moteur qui peut cultiver des sphéroïdes cellulaires. À l'aide de cet appareil, les sphéroïdes de types de cellules simples ou multiples pourraient être facilement cocultivés dans des conditions de haute gravité.

Plateforme Lab-on-a-CD pour générer des sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels

Ici, nous décrivons la production à grande échelle de sphéroïdes stromaux / cellules souches (ASC) dérivés des adipeux à l’aide d’un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Ces sphéroïdes ASC peuvent être utilisés comme blocs de construction pour les approches de bio-impression 3D.

Production automatisée à grande échelle de sphéroïdes de cellules souches dérivées de cellules adipeuses pour la bioimpression 3D

Le protocole actuel décrit une technique permettant de produire des sphéroïdes tissulaires à grande échelle de manière rentable à l’aide d’un dispositif imprimé en 3D semblable à un tampon.

Génération de sphéroïdes tissulaires à l’aide d’un dispositif imprimé en 3D semblable à un tampon

Ce protocole détaille l’isolement des chondrocytes, des chondroprogéniteurs dérivés du test d’adhésion à la fibronectine (FAA-CP) et des chondroprogéniteurs migrateurs (MCP) du cartilage articulaire humain. Il couvre la digestion enzymatique, l’adhésion de la fibronectine et les tests basés sur la migration pour isoler et caractériser ces cellules.

Isolement de chondrocytes et de chondroprogéniteurs à l’aide de l’adhésion de la fibronectine et du dosage migratoire

Cette étude présente une méthodologie rentable et efficace pour générer des structures cellulaires 3D à l’aide d’un système basé sur des tampons pour créer des micropuits dans des moules d’agarose. Le système favorise la formation de sphéroïdes/organoïdes uniformes, améliorant ainsi les interactions cellulaires. Cette approche réduit la variabilité expérimentale et soutient les applications dans les tests de médicaments et l’ingénierie tissulaire.

Génération de sphéroïdes/organoïdes tridimensionnels à partir de cultures cellulaires bidimensionnelles à l’aide d’un nouveau dispositif de tamponnage

Découvrez la génération de sphéroïdes chondrocytaires à partir de cellules iPSCs pour la réparation du cartilage. Cette méthode utilise des mini-bioréacteurs et des conditions de faible adhérence.

Génération de sphéroïdes à partir de divers chondrocytes à l’aide de conditions à faible adhérence sous gravité et de mini-bioréacteurs faits maison (Vidéo) | JoVE Journal

Génération de sphéroïdes à partir de divers chondrocytes à l’aide de conditions à faible adhérence sous gravité et de mini-bioréacteurs faits maison

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