Un flux de travail simple et rapide pour la quantification des structures externes de la drosophile adulte

Notre laboratoire s’intéresse à comprendre comment la dynamique du pH intracellulaire module les comportements cellulaires. Nous nous intéressons aux comportements qui contribuent à la progression du cancer car nous savons que le pH intracellulaire est augmenté dans la plupart des cancers. Nous faisons beaucoup de microscopie et développons des protocoles pour quantifier les données de ces images.

Nous en apprenons davantage sur les voies et les processus cellulaires qui sont régulés par le pH. La plupart des lignées cellulaires cancéreuses ont un pH intracellulaire plus élevé et beaucoup présentent des niveaux accrus d’autophagie, mais nous ne savions pas que cela était lié. Nous avons récemment montré qu’un pH intracellulaire plus élevé dans des cellules génétiquement normales est suffisant pour augmenter l’autophagie.

Notre laboratoire est l’un des rares laboratoires à étudier comment le pH intracellulaire ou PHI régule les comportements cellulaires dans un modèle animal entier. Nous avons constaté que l’augmentation des PHI favorise une prolifération cellulaire accrue, une migration cellulaire invasive et une désorganisation des tissus. Plus récemment, nous avons constaté qu’un DAP plus élevé favorise l’autophagie, qui est une forme de cannibalisme cellulaire.

Nous comblons l’écart créé par le coût élevé et la complexité de la préparation des échantillons pour la MEB, ce qui limite son accessibilité pour de nombreux laboratoires. À San Jose State, nous manquons de ressources pour le SEM. Nous avons donc développé un protocole plus accessible et abordable nous permettant de capturer les images haute résolution sans avoir besoin d’un équipement coûteux.

Ce protocole combine des techniques traditionnelles utilisées en entomologie et offre une alternative rentable et conviviale à la microscopie électronique à balayage. Il peut être facilement adapté pour capturer des images haute résolution de différentes parties de la mouche ou de différents spécimens. Pour commencer, sélectionnez la souche de drosophile souhaitée et placez-la dans un flacon contenant de la nourriture pour mouches.

Incuber la fiole à 25 degrés Celsius jusqu’à ce que les mouches aient grandi et que les adultes soient proches. Ensuite, anesthésez les mouches adultes avec du dioxyde de carbone et placez-les sur un tampon de dioxyde de carbone. Préparez un trieur de mouches à plumes en taillant une plume d’oie pour qu’elle s’adapte à l’extrémité effilée d’une pipette sérologique d’un millilitre.

Triez les mouches avec une plume et sélectionnez les individus avec des ailes droites. Ensuite, ajoutez un millilitre d’éthanol à 70 % dans un microtube à centrifuger de 1,7 millilitre. Transférez les mouches sélectionnées dans le tube et placez le tube sur de la glace.

À l’aide d’un poinçon spécialisé. Découpez de petites pointes triangulaires dans du papier cartonné d’archives de 65 livres. Ensuite, utilisez la pince à pointe fine numéro cinq de Dumont pour plier la pointe de chaque point à un angle de 90 degrés.

Retirez les mouches du tube de micro-centrifugeuse à l’aide de la pince à pointe fine numéro cinq de Dumont. Épongez doucement les mouches avec un chiffon non pelucheux pour éliminer l’excès d’éthanol. Placez chaque mouche sur son côté gauche sur une fiche sous un microscope à dissection.

À l’aide d’une pipette de transfert, mélangez une à deux gouttes de colle de peau avec une à deux gouttes d’eau déminéralisée sur une fiche. Prenez une pointe de carte préparée à l’extrémité large avec une pince et tamponnez la pointe pliée dans le mélange d’eau de colle pour appliquer une petite quantité de colle. Appliquez l’extrémité courbée de la pointe de la carte sur le côté antérieur de l’abdomen droit de la mouche autour des segments abdominaux deux et trois.

Avant que la colle ne sèche, ajustez la braguette de manière à ce que son axe antérieur postérieur soit perpendiculaire à la pointe pliée de la pointe de la carte. Insérez une goupille de montage numéro trois dans l’extrémité large de la pointe de la carte et fixez-la à un bloc d’épinglage d’insectes. Étiquetez chaque épingle ou rangée d’épingles avec le génotype correspondant.

Pour acquérir des photographies haute résolution de drosophiles montées ponctuelles, les yeux allument le système d’imagerie par empilement. Ensuite, installez un boîtier d’appareil photo reflex numérique avec un téléobjectif de 70 à 200 millimètres fixé à un objectif de microscope Apo 20x via un adaptateur d’objectif de 77 millimètres. Assurez-vous que l’échantillon est éclairé par un flash à travers un diffuseur.

Contrôlez le positionnement Z de la caméra à l’aide d’un contrôleur StackShot et d’un rail macro. Positionnez la mouche montée sur le cardan de platine universel avec l’œil face à l’objectif. Ajustez la position de la tête à l’aide d’une pince pour un alignement optimal.

Connectez l’appareil photo à un ordinateur portable et ajustez les paramètres d’acquisition. Réglez le grossissement sur 20x, la vitesse d’obturation, 1/200 de seconde, l’ouverture f/2.8 et ISO 400. Ensuite, définissez l’emplacement d’enregistrement de la pile d’images résultante dans le dossier de fichiers souhaité.

Maintenant, ajustez les paramètres de la pile de mise au point sur l’unité de contrôle StackShot en mode de distance automatique. Réglez la taille du pas à cinq micromètres et calculez le nombre de pas en réglant les positions de début et d’arrêt de la pile de mise au point. Visualisez l’échantillon en mode de visualisation en direct avec l’appareil photo en mode de prise de vue automatique.

Déplacez le rail de manière à ce que la partie la plus proche de l’échantillon soit nette. Ensuite, passez à l’élément d’intérêt le plus éloigné et ajustez la mise au point. Remettez l’appareil photo en mode de prise de vue manuel et démarrez l’acquisition d’images à partir de l’unité de commande StackShot.

Après l’imagerie, ouvrez les fichiers d’image acquis dans le logiciel d’empilement de mise au point référencé. Sélectionnez Empiler, puis aligner et empiler tout ou Pmax pour générer une image empilée. Cliquez ensuite sur Fichier et enregistrez l’image de sortie pour enregistrer l’image empilée finale en tant que fichier tif.

Après avoir numérisé les yeux de drosophile montés sur des broches, sélectionnez l’image empilée pour l’analyse où l’œil est centré et aligné avec un éclairage adéquat et un flou périphérique minimal. Ouvrez l’image de la barre à l’échelle 500 micromètres dans le logiciel Fidji. Mesurez la longueur de la barre d’échelle à l’aide de l’outil Ligne droite.

Cliquez sur Analyser et mesurer pour enregistrer la distance en pixels, qui correspond à 500 micromètres. Ensuite, calculez les pixels par micron et utilisez-le pour convertir les mesures de pixels en mesures micrométriques. Ouvrez le fichier image empilé aux Fidji.

Sélectionnez Loupe dans la barre d’outils pour agrandir la zone de mise au point. Remplissez l’écran avec l’œil et la cuticule de la tête environnante. Ensuite, dans la barre d’outils, sélectionnez l’outil de sélection à main levée et tracez le contour de la zone rétinienne en suivant la rangée la plus externe d’ommatidies.

Pour supprimer une partie de la sélection, maintenez le bouton d’option enfoncé et sélectionnez les pixels à supprimer. Pour ajouter à la sélection, maintenez les boutons Option et Maj enfoncés et sélectionnez les pixels à ajouter. Pour calculer la surface, sélectionnez Analyser et mesurer.

Une nouvelle fenêtre affichera les paramètres de surface, de moyenne, minimum et maximum. Copiez et collez les données dans une feuille de calcul pour la documentation et la conversion des mesures en pixels en mesures micrométriques. La surexpression de DNhe2 chez les mouches GMR-DNhe2 a entraîné des yeux adultes significativement plus petits par rapport aux mouches adultes de type sauvage.

Les mouches GMR-DNhe2 ont montré une réduction de 41 % du contour des yeux par rapport aux mouches de type sauvage et une réduction de 48 % par rapport aux mouches hétérozygotes GMRGAL4. La taille de l’œil a été restaurée chez les mouches GMR-DNhe2 hétérozygotes pour l’allèle 3 Atg1, la portant à 129,9 micromètres carrés contre 74,28 micromètres carrés.