Name: Un flux de travail simple et rapide pour la quantification des structures externes de la drosophile adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez un protocole d'imagerie à haute résolution et peu coûteux pour quantifier les défauts de croissance et de structure des yeux de Drosophila adulte. Cette méthode accessible remplace la microscopie électronique à balayage.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Collecte et fixation de la drosophile adulte
<ol>
	<li>Mettez en place des croisements de drosophiles ou sélectionnez des souches et placez-les dans des flacons contenant de la nourriture pour mouches. Incuber les flacons à la température désirée (généralement 25 °C) jusqu’à ce que les mouches se soient développées et que les adultes se rapprochent (~10-14 jours à 25 °C).</li>
	<li>Anesthésez les mouches avec du CO2 et placez-les sur un tampon de CO2 .</li>
	<li>Triez les mouches à l’aide d’une plume et sélectionnez les individus ayant le phénotype souhaité (par exemple, des ailes droites). Fabriquez un trieur de mouches à plumes en taillant une plume d’oie pour qu’elle s’insère dans l’extrémité effilée d’une pipette sérologique de 1 ml.</li>
	<li>Préparez un tube de microcentrifugation de 1,7 mL avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Placez les mouches sélectionnées dans le tube de microcentrifugation et mettez-les sur de la glace. Conservez les tubes de microcentrifugation à 4 °C pendant la nuit (Figure 2A). REMARQUE : Ne conservez pas les mouches dans de l’éthanol pendant plus de 24 heures. Le stockage à long terme des mouches dans de l’éthanol à 70 % entraînera une perte de pigment pour les yeux et le corps.</li>
</ol>
2. Préparation de l’échantillon par montage ponctuel
REMARQUE : Les drosophiles sont des insectes à corps mou qui deviennent cassants et s’effondrent lorsqu’ils sont séchés à l’air ; Par conséquent, ce protocole exige que les échantillons soient imagés le jour même de leur montage. Travaillez en petits groupes de ~5 mouches à la fois pour éviter la perte d’échantillon. Augmentez le nombre d’échantillons dans un ensemble en fonction de l’efficacité. Les échantillons qui nécessitent plus de temps avant l’imagerie peuvent être déshydratés par une série de concentrations croissantes d’hexaméthyldisilazane (HMDS)14.
<ol>
	<li>Découpez de petites pointes triangulaires (7,1 mm x 2,7 mm) dans du papier cartonné d’archives de 65 lb à l’aide d’une perforatrice spécialisée. Préparez les pointes en pliant la pointe (la plus étroite 25 %) à un angle de 90° à l’aide d’une pince à pointe fine Dumont #5 (figure 2B).</li>
	<li>À l’aide d’une pince à pointe fine Dumont #5, retirez les mouches des tubes de la microcentrifugeuse (étape 1.4). Épongez doucement les mouches avec un tissu de laboratoire non pelucheux pour éliminer l’excès d’éthanol. Positionnez chaque mouche sur son côté gauche sur une fiche sous un microscope à dissection. REMARQUE : Retirez les mouches du tube en les tenant à une structure anatomique qui n’est pas la zone d’intérêt - lors de l’imagerie de la tête, nous tenons des échantillons par l’aile ou la patte. Ne tenez pas les échantillons par l’abdomen, car cette structure est utilisée pour coller la mouche sur la pointe de la carte.</li>
	<li>Préparez la colle à peau en ajustant sa consistance à la viscosité souhaitée. Mélangez 1 à 2 gouttes de colle de peau avec 1 à 2 gouttes d’eau déminéralisée (DI) et mélangez avec une pipette de transfert sur une fiche. Prenez une pointe de carte préparée à l’extrémité large à l’aide d’une pince et placez une petite quantité de colle diluée sur la pointe pliée de la pointe en la tamponnant dans le mélange colle-eau (Figure 2C). REMARQUE : La colle doit être étalable mais pas coulante.</li>
	<li>Appliquez l’extrémité pliée de la pointe sur la face antérieure de l’abdomen droit, autour des segments abdominaux 2 et 3 (figure 2C). Avant que la colle ne sèche, effectuez de légers ajustements sur la mouche de sorte que l’axe antéro-postérieur de la mouche soit perpendiculaire à la pointe courbée de la pointe.</li>
	<li>Insérez une goupille de montage n° 3 dans l’extrémité large de la pointe de la carte (Figure 2D) et fixez-la à un bloc d’épingle à insectes (Figure 2E). Étiquetez chaque épingle ou rangée d’épingles avec le génotype correspondant.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig02.jpg"> 
Figure 2 : Préparation de l’échantillon. (A) Les drosophiles adultes sont triées en fonction de marqueurs phénotypiques et rassemblées dans des tubes de microcentrifugation étiquetés contenant 70 % d’éthanol sur de la glace. Les mouches sont stockées à 4° C pendant la nuit. (B) Les pointes de la carte en papier sont préparées en pliant l’extrémité étroite à 90° du reste de la carte à l’aide d’une paire de pinces #5. (C) Les mouches sont récupérées des tubes et brièvement laissées sécher à l’air. La colle de peau est appliquée sur la petite extrémité pliée de la pointe de la carte préparée et collée sur la mouche adulte au niveau des segments abdominaux 2-3. (D) Les spécimens sont montés, avec une étiquette d’identification, sur une épingle à insectes en acier inoxydable #3. (E) Les échantillons épinglés sont stockés sur une carte d’échantillonnage jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’acquisition de l’image. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Acquisition d’images par empilement de mise au point haute résolution
<ol>
	<li>Acquérez des photographies haute résolution d’yeux de mouches à l’aide d’un système d’imagerie d’empilement de mise au point assemblé et personnalisé.<ol>
		<li>Prenez des photos avec un boîtier d’appareil photo reflex numérique doté d’un téléobjectif 70-200 mm connecté à un objectif Apo Microscope 20x via un adaptateur d’objectif 77 mm.</li>
		<li>Assurez-vous que l’échantillon est éclairé par un flash à travers un diffuseur (Figure 3).</li>
		<li>Contrôlez le positionnement Z à l’aide d’un contrôleur Stackshot et d’un rail macro.</li>
		<li>Connectez l’appareil photo, le flash et la platine motorisée à un trépied en aluminium anodisé robuste.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Positionnez chaque échantillon monté sur un cardan de platine universel, la tête orientée de manière à ce que l’œil soit tourné vers l’objectif. Ajustez la position de la tête en déplaçant doucement la tête avec la pince. ATTENTION : Des ajustements importants et rapides peuvent entraîner une décapitation accidentelle.</li>
	<li>Avec l’appareil photo connecté à un ordinateur portable, ajustez les paramètres d’acquisition dans le logiciel. Photographiez des spécimens avec un grossissement de 20x avec les paramètres suivants : puissance du flash 1/32, vitesse d’obturation 1/200, ouverture F2.8 et ISO 400. Assurez-vous que toutes les fonctions de mise au point automatique et de stabilisation d’image sont désactivées. REMARQUE : ces paramètres équilibrent l’éclairage optimal du flash, la vitesse d’obturation et la profondeur de champ. Ils devraient être ajustés pour d’autres grossissements et/ou combinaisons de lentilles.</li>
	<li>Définissez l’emplacement d’enregistrement de la pile d’images résultante (10 à 50 images) dans le dossier de fichiers souhaité. Assurez-vous d’une capacité de stockage suffisante pour les images (~8,5 Mo par image).</li>
	<li>Ajustez les paramètres de la pile de mise au point sur l’unité de commande Stackshot en mode Distance automatique .<ol>
		<li>Réglez la taille du pas sur 5 μm et calculez le nombre de pas en réglant les positions de début et de fin de la pile de mise au point.</li>
		<li>Visualisez l’échantillon en mode LiveView et avec l’appareil photo en mode de prise de vue automatique pour identifier les positions de démarrage et d’arrêt.</li>
		<li>Déplacez le rail de manière à ce que la partie la plus proche de l’échantillon soit nette (position de départ définie), puis déplacez-vous jusqu’à l’endroit où l’élément d’intérêt le plus éloigné est net (position finale définie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remettez l’appareil photo en mode de prise de vue manuel et démarrez l’acquisition d’images à partir de l’unité de commande Stackshot. REMARQUE : Le temps d’acquisition de l’image dépend de la taille de l’échantillon. Plus la profondeur de champ nécessaire pour les grands échantillons est grande, plus il y a de coupes incluses dans la pile d’images, ce qui prolongera le temps d’acquisition global.</li>
	<li>Ouvrez les fichiers dans le logiciel d’empilement de focus référencé. Générez une image empilée en cliquant sur Pile | Aligner et empiler tout (PMax).</li>
	<li>Enregistrez l’image finale sur le disque dur de l’ordinateur en tant que fichier .tif en cliquant sur Fichier | Enregistrer l’image de sortie. REMARQUE : En fonction de la résolution du fichier d’image empilé et du nombre d’échantillons imagés, des disques durs externes de grande taille (1 To) peuvent être nécessaires pour la sauvegarde des images. Dans ce protocole, les images empilées font environ 100 Mo chacune avant d’être compressées.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig03.jpg"> 
Figure 3 : Acquisition d’images. (A) Appareil d’imagerie avec des pièces étiquetées comme suit : a) Corps d’appareil photo reflex numérique ; b) téléobjectif ; c) Objectif et adaptateur Apo Microscope 20x ; d) Flash ; e) Diffuseurs à lentille et à dôme ; f) Contrôleur Stackshot, Macro Rail et Platine rotative ; g) Cardan de scène universel ; h) Trépied. (B) Appareil d’imagerie avec diffuseur de lumière en place. (C) Gros plan de l’échantillon monté en position pour l’imagerie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
4. Flux de travail d’analyse FIJI pour calculer le contour des yeux adultes
<ol>
	<li>Pour l’analyse d’images, procurez-vous le logiciel FIJI15 sur le site Web de ImageJ.net.</li>
	<li>Choisissez des images pour l’analyse où l’œil est centré et aligné avec un éclairage adéquat et un flou périphérique minimal, indiquant un alignement correct avec la caméra.</li>
	<li>Calibrez l’échelle de l’image.<ol>
		<li>Téléchargez l’image de la barre d’échelle pour un grossissement de 20x qui correspond à 500 μm. Alternativement, au moment de l’acquisition de l’image, photographiez une règle en utilisant les mêmes paramètres. Ouvrez l’image dans FIJI Software.</li>
		<li>Mesurez la longueur de la barre d’échelle (Figure 4A). Utilisez l’outil Ligne droite pour tracer exactement la ligne. Cliquez sur Analyser | Mesurer. Cette distance de pixel est équivalente à 500 μm (Figure 4B).</li>
		<li>Calculez les pixels par micron. Utilisez cette option pour convertir les mesures de pixels en mesures micrométriques.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ouvrez le fichier d’image empilée dans FIJI (Figure 4C).</li>
	<li>Sélectionnez Loupe dans la barre d’outils pour agrandir la zone de mise au point. Essayez de remplir l’écran avec l’œil et la cuticule de la tête qui l’entoure immédiatement (Figure 4D).</li>
	<li>Sélectionnez Sélectionner un outil à main levée dans la barre d’outils. Délimitez la région rétinienne le plus près possible, en suivant les contours de la rangée la plus externe d’ommatidies (Figure 4E). Pour supprimer une partie de la sélection, maintenez le bouton d’option enfoncé et sélectionnez les pixels à supprimer. Pour ajouter à la sélection, maintenez les boutons Option et Maj enfoncés et sélectionnez les pixels à ajouter.</li>
	<li>Pour calculer la surface, sélectionnez Analyser | Mesurez à partir du menu supérieur (Figure 4F). Une nouvelle fenêtre apparaîtra avec les paramètres area, mean, minimum et maximum . Copiez et collez ces données dans une feuille de calcul pour la documentation et la conversion des mesures en pixels en mesures micrométriques.</li>
	<li>Effectuer des analyses statistiques appropriées.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig04.jpg"> 
Figure 4 : Analyse de l’image en FIDJI. (A) Mettre à l’échelle l’image originale. Téléchargez l’image d’étalonnage et mesurez la longueur de la barre de 500 μm. (B) Ajustez la mise à l’échelle à l’aide de la fonction Set Scale. (C) Ouvrez l’image empilée. (D) Agrandissez l’image de sorte que l’œil soit centré et presque plein écran. (E) Utilisez l’outil Sélection à main levée pour tracer le contour de l’œil à la frontière entre la rangée la plus externe d’ommatidies et la cuticule environnante. (F) Mesurer la surface dans la région sélectionnée est calculé en cliquant sur Analyser | Mesurer | Aire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Imagerie et analyse à haute résolution des anomalies oculaires de la drosophile

<ol><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+models+of+invasive+tumorigenesis+for+in+vivo+studies+on+tumour%2Fperipheral+host+tssue+interactions+during+cancer+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia.</a> Int J Mol Sci. 22 (15), 8317(2021).</li>
<li>Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+in+cancer%3A+mechanistic+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila.</a> Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934(2021).</li>
<li>Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+Drosophila+genetics+and+its+insight+into+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease.</a> Front Mol Biosci. 9, e1060796(2022).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reclaiming+Warburg%3A+using+developmental+biology+to+gain+insight+into+human+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases.</a> Development. 147 (11), dev189340(2020).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li>
<li>Johnson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexagonal+patterning+of+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hexagonal patterning of the Drosophila eye.</a> Dev Biol. 478, 173-182 (2021).</li>
<li>Weasner, B. P., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+history+of+the+eye-antennal+disc+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 221 (1), iyac041(2022).</li>
<li>Pichaud, F., Casares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+an+optical+dome%3A+The+size+and+shape+of+the+insect+compound+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).</li>
<li>Oster, I. I., Crang, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+Drosophila+mutant+and+wild+type+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Microsc+Soc%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes.</a> Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).</li>
<li>Gibb, T. J., Oseto, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGibb%2C+TJ+%22Insect+collection+and+identification%3A+Techniques+for+the+field+and+laboratory%22">Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+cost+compact+cameras+with+focus+stacking+functionality+in+entomological+digitization+projects%5BTitle%5D)+AND+%22ZooKeys%22%5BJournal%5D)">The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects.</a> ZooKeys. 712, 141-154 (2017).</li>
<li>Brown, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+further+chemical+alternative+to+critical-point-drying+for+preparing+small+%28or+large%29+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+Times%22%5BJournal%5D)">A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies.</a> Fly Times. 11, 10(1993).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Method%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 4, e03270(2015).</li>
<li>White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+behaviors+mediated+by+dysregulated+pH+dynamics+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance.</a> J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).</li>
<li>Peralta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Nhe2+overexpression+induces+autophagic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death.</a> Mol Biol Cell. 35 (7), br13(2024).</li>
<li>Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+A+platform+for+anticancer+drug+discovery+and+personalized+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies.</a> Front Genet. 13, 949241(2022).</li>
<li>Nitta, Y., Sugie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+neurodegenerative+diseases+using+Drosophila+and+the+development+of+novel+approaches+for+their+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis.</a> Fly. 16 (1), 275-298 (2022).</li>
<li>Pletcher, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+using+the+Drosophila+melanogaster+TRiP+RNAi+collection+to+identify+metabolic+enzymes+required+for+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).</li>
<li>Bangi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+platform+identifies+trametinib+plus+zoledronate+for+a+patient+with+KRAS-mutant+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer.</a> Sci Adv. 5 (5), eaav6528(2019).</li>
</ol>

Drosophila melanogaster est un puissant organisme modèle génétique qui est utilisé depuis des décennies pour élucider les voies de signalisation moléculaire et les comportements cellulaires. De nombreuses voies de signalisation conservées au cours de l’évolution, essentielles au développement multicellulaire, ont été identifiées pour la première fois et leur mécanisme d’action défini chez la drosophile. Environ 65 à 75 % de tous les gènes associés aux maladies humaines ont des orthologues chez la drosophile 1,2. L’œil de la drosophile adulte est un modèle important qui a permis des criblages génétiques impartiaux qui ont facilité la découverte d’importants gènes conservés impliqués dans des maladies humaines, notamment le cancer 3,4, la neurodégénérescence5 et les troubles métaboliques6.
L’œil de la drosophile est composé de ~800 yeux unitaires, appelés ommatidies, qui sont disposés avec précision dans un motif hexagonal sur la surface de l’œil adulte7. Chaque ommatidium est composé de huit neurones photorécepteurs qui occupent un emplacement distinct dans un trapèze asymétrique. Ceux-ci sont soutenus par quatre cellules coniques non neurales et deux cellules pigmentaires primaires qui sécrètent le cristallin et le pseudo-cône pour concentrer la lumière sur les rhabdomères sensibles à la lumière des neurones photorécepteurs. Les ommatidies voisines sont séparées par une seule rangée de cellules de réseau interommatidiennes, composée de cellules pigmentaires secondaires, de cellules pigmentaires tertiaires et de complexes de poils mécanosensoriels 8,9,10.
Les perturbations du développement oculaire sont visibles chez les yeux adultes sous la forme d’une augmentation ou d’une diminution de la taille de l’œil, d’une abondance ou d’une structure anormale des lentilles ou des poils, ou d’un « œil rugueux » où le motif hexagonal normalement invariant est perturbé de sorte qu’une rangée d’ommatidies ne peut plus être suivie à la surface de l’œil. Ces phénotypes peuvent être notés au niveau des tissus macroscopiques à l’aide de microscopes à dissection. L’analyse détaillée des phénotypes comprend traditionnellement la microscopie électronique à balayage suivie d’une analyse quantitative d’images11. Cependant, la microscopie électronique à balayage nécessite des instruments coûteux, des réactifs coûteux, une préparation d’échantillons qui s’étend sur des jours et, souvent, du personnel à temps plein.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig01v2.jpg"> 
Figure 1 : Flux de travail pour l’imagerie des structures de la drosophile adulte. (A) Recueillir et fixer la drosophile adulte dans de l’éthanol à 70 %. (B) Préparer les échantillons pour l’imagerie par montage ponctuel et fixation sur des broches. (C) Acquérir des images haute résolution grâce à l’empilement et à l’intégration de la mise au point. (D) Quantifier les images à l’aide des FIDJI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Cet article présente un flux de travail relativement peu coûteux, qui a un temps de préparation d’échantillon court, qui peut facilement être installé sur une paillasse de laboratoire de 3 pieds, qui ne nécessite pas de matières dangereuses et qui pourrait être un ajout à longue durée de vie aux laboratoires de recherche sur la drosophile (Figure 1). Le montage ponctuel est une technique entomologique utilisée pour sécher à l’air libre et conserver les petits insectes à corps mou, tels que la drosophile12. Cette méthode repose sur la combinaison d’objectifs de microscope avec des appareils photo reflex numériques haute résolution pour des grossissements efficaces de 10x à 1 000x. La profondeur de champ limitée inhérente à la macrophotographie est surmontée par l’empilement de mise au point : assembler une série d’images avec le plan focal se déplaçant à travers l’échantillon d’intérêt13. Cette méthode produit des images à haute résolution adaptées à la quantification des phénotypes et pourrait facilement être adaptée à d’autres structures d’intérêt, telles que l’aile, la patte, le thorax et l’abdomen. Le flux de travail d’analyse d’images utilise le programme gratuit d’analyse d’images FIJI (NIH ImageJ). Cette méthodologie rend la préparation d’échantillons, l’imagerie haute résolution et l’analyse accessibles aux étudiants de premier cycle et aux scientifiques des établissements défavorisés.

<table><tbody><tr><td>Pipette sérologique de 1 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170353N</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific&nbsp ;</td><td>24-282LR</td><td></td></tr><tr><td>20x Apo microscope Objectif</td><td>Mitutoyo Corp.</td><td>378-804-3</td><td></td></tr><tr><td>Papier cartonné d’archives de 65 lb.</td><td>Neenah, Inc.</td><td>91901</td><td></td></tr><tr><td>Téléobjectif Canon EF 70-200 mm USM II</td><td>Canon</td><td>3044C002</td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 6D Mark II Boîtier d’appareil photo reflex numérique</td><td>Canon</td><td>1897C002</td><td></td></tr><tr><td>Dôme de diffuseur</td><td>Solutions macroscopiques&nbsp ;</td>Diffuseur <td>PA-DIF-GIM-SM</td><td></td></tr><tr><td>pour Mitutoyo M Plan APO Objectifs</td><td>Solutions macroscopiques&nbsp ;</td><td>mitutoyo-diffuseurs</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila flacons et bouchons</td><td>Genesee Scientific&nbsp ;</td><td>32-117BF</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pince à pointe fine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9889584</td><td></td></tr><tr><td>plumes d’oie</td><td>Amazon</td><td>B01CMMJI6U</td><td></td></tr><tr><td>Trépied en aluminium anodisé robuste</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>TFA-32G</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>tissu de laboratoire non pelucheux</td></tr><tr><td>Levenhuk M1000 Plus Appareil photo</td> <td>numériqueLevenhuk</td><td>70358</td><td></td></tr><tr><td>N° 3 goupille de montage</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-3</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Bloomington Drosophila media</td><td>Genesee Scientific&nbsp ;</td><td>66-113</td><td>nourriture pour mouches</td></tr><tr><td>Point-Punch</td><td>M.C. Mieth Manufacturing, Inc.</td><td>448Detail</td><td></td></tr><tr><td>Screwknob Clamp</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>SK-Clamp</td><td>Pour fixer le rail macro au trépied</td></tr><tr><td>Stackshot Controller et Macro Rail</td><td>Cognisys Inc.</td><td></td><td></td>ST3X_100_BUNDLE</tr><tr><td>Adaptateur de bague abaisseur&nbsp ;</td><td>Appareil photo RAF</td><td>763461174207</td><td>Adaptateur d’objectif pour connecter l’objectif du microscope à l’objectif de l’appareil photo</td></tr><tr><td>Titebond Glue</td><td>Franklin International</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash</td><td>Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.</td><td>YN-24EX</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS Utility (v. 3.16.1).&nbsp ;</td>Le <td>logiciel d’acquisition</td> <td>Canon</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Fiji est publié en open source sous la licence publique générale GNU. FIDJI Version 2.14.0/1.54f&nbsp ;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, Boston, Massachusetts États-Unis</td><td></td><td>Prism Version 10.3.1</td></tr><tr><td>Zerene Stacker (v.1.04)</td><td>Zerene Systems, LLC</td><td></td><td>Focus Stacking Software</td></tr></tbody></table>

un flux de travail simple et rapide pour la quantification des structures externes de la drosophile adulte

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

L’œil de la drosophile est un excellent système modèle pour l’étude de la structure des tissus, du contrôle de la croissance et de la mort cellulaire. Nous avons récemment publié une étude sur la façon dont le pH intracellulaire (pHi) influence la croissance des tissus. Tout d’abord, nous avons établi un système génétique où la surexpression de l’échangeur sodium-proton DNhe2 (l’orthologue de NHE1 chez les mammifères) dans l’œil en développement provoque des défauts de structuration et une prolifération accrue16. Une prolifération accrue avec un pHi plus élevé est observée chez toutes les espèces, des levures aux mammifères17. Cependant, nous avons également observé qu’avec une augmentation du pHi, la taille de l’œil adulte semblait plus petite par rapport aux témoins.
Une analyse quantitative du contour de l’œil adulte a été effectuée pour déterminer comment une expression élevée de DNhe2 diminue la taille des tissus de l’œil de la drosophile . Nous avons d’abord acquis des images à faible résolution à l’aide d’un microscope à insert oculaire (Figure 5A), mais celles-ci étaient de qualité insuffisante pour effectuer des mesures quantitatives. Plus précisément, les bords de l’œil ne sont pas nets, ce qui empêche une mesure précise de la zone oculaire.
Nous avons mesuré la surface de chaque œil dans des images haute résolution d’yeux de drosophile adultes (Figure 5B). Les mouches exprimant la GMR&gt;DNhe2 avaient des yeux significativement plus petits (moyenne de 74,28 μm2) que les mouches témoins de fond génétique w1118 (moyenne de 125,83 μm2) ou que les mouches hétérozygotes de contrôle GMRGAL4 du conducteur (moyenne de 142,49 μm2), ce qui représente une réduction de 41 % et de 48 % de la surface, respectivement (figure 5C). Cette diminution de la taille des yeux, malgré une prolifération accrue, pourrait être attribuée à des niveaux élevés de mort cellulaire.
Des gènes d’autophagie connus, y compris Atg1, qui induit la formation de phagophore, ont été utilisés dans des études d’interaction génétique (Figure 5). Les effets sur la taille des yeux des adultes ont été quantifiés à l’aide de photographies à haute résolution et d’analyses de surface (figure 5B). La taille de l’œil a été restaurée (129,9 μm2 contre 74,28 μm2) chez les mouches GMR&gt;DNhe2 hétérozygotes pour Atg13 par rapport à GMR&gt;DNhe2 seule et était similaire à celle des témoins (Figure 5C). Combinés à l’analyse des marqueurs moléculaires, nos résultats confirment une augmentation de la mort cellulaire autophagique à un pH plus élevé.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig05.jpg"> 
Figure 5 : Sauvetage d’une diminution de la taille de la rétine associée à une augmentation du pH intracellulaire avec une diminution de l’autophagie. (A) Images à basse résolution d’yeux de mouches adultes prises avec un microscope à insert oculaire. (B) Images à haute résolution d’yeux de mouches adultes utilisées pour la quantification de la taille des yeux pour les génotypes suivants : w1118 ; GMRGAL4 ; GMR&gt;DNhe2 ; GMRGAL4 ; Atg13 ; GMR&gt;DNhe2 ; Atg13. (C) Les tailles moyennes mesurées des yeux des adultes étaient les suivantes : w1118 (125,83 μm2, N = 7) ; GMRGAL4 (142,49 μm2, N = 9) et GMR&gt;DNhe2 (74,28 μm2, N = 6), GMRGAL4 ; Atg13 (146,4 μm2, N = 15) ; GMR&gt;DNhe2 ; Atg13 (129,9 μm2, N = 19) et indiqué par l’affichage des valeurs médianes avec des écarts interquartiles. La signification statistique a été déterminée par des tests t non appariés avec correction de Welch. Les données des catégories B et C ont été publiées antérieurement18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Nos conclusions sont renforcées par la préparation de l’échantillon, l’imagerie à haute résolution et l’analyse décrite ici. Ces méthodes ont permis une description précise et quantitative de la taille des yeux de la drosophile adulte avec différents génotypes. Nous continuons d’utiliser cette approche pour évaluer d’autres interactions génétiques qui permettront d’élucider les mécanismes de contrôle de la croissance dépendant du pH.

Un flux de travail simple et rapide pour la quantification des structures externes de la drosophile adulte

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

a-rapid-simple-workflow-for-quantification-external-adult-drosophila

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Les muscles de vol de la drosophile sont utilisés comme système modèle pour le développement musculaire et la physiologie. Cette vidéo décrit la musculature de vol des adultes et met en évidence un protocole pour disséquer les muscles de vol indirect en développement qui conviennent au séquençage de l’ARN des nymphes.

drosophile Dissection musculaire de vol indirect (IFM) de la chrysalide tardive : une méthode de prélèvement de tissus à haut débit

La morphologie, la taille et l’emplacement des organites intracellulaires sont conservés au cours de l’évolution et semblent affecter directement leur fonction. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces processus est devenu un objectif important de la biologie moderne. Nous montrons ici comment ces études peuvent être facilitées par l’application de techniques quantitatives.

Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire

L'adulte drosophile cerveau est un système utile pour l' étude de circuits neuronaux, les fonctions supérieures du cerveau et des troubles complexes. Une méthode efficace pour disséquer tout le tissu du cerveau de la petite tête de mouche facilitera les études basées sur le cerveau. Nous décrivons ici une seule étape simple protocole, de la dissection des cerveaux adultes avec une morphologie bien préservée.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Deux algorithmes d'analyse d'images, « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie » ont été créés, pour quantifier automatiquement neuf caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire drosophile (NMJ).

Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de<em&gt; drosophile</em&gt; Junction neuromusculaires Morphology

Ce travail présente une méthode pour quantifier rapidement et précisément la pigmentation abdominale de Drosophila melanogaster en utilisant l'analyse d'image numérique . Cette méthode rationalise les procédures entre l'acquisition du phénotype et l'analyse des données et comprend le montage des échantillons, l'acquisition d'image, l'extraction de la valeur des pixels et la mesure des traits.

Quantifier la pigmentation abdominale dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Ce protocole met l’accent sur l’analyse quantitative de la complexité de l’arborisation dendritique neuronale (NDAC) chez la drosophile, qui peut être utilisé pour l’étude de la morphogenèse dendritique.

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Ce protocole décrit un test in vivo de phagocytose utilisé pour évaluer et quantifier la capacité des jeunes et âgés Drosophila melanogaster hémocytes aux bactéries phagocytose.

Évaluation de la capacité phagocytique spécifique à l’âge des hémocytes adultes de Drosophila melanogaster à l’aide d’un test de phagocytose in vivo

Un protocole est présenté qui permet la visualisation de Drosophila melanogaster intact à n’importe quel stade de développement à l’aide de la tomographie microcalculée.

Imagerie d’animaux entiers de Drosophila melanogaster à l’aide de la tomographie microcalculée

Le système oculaire de la drosophile est un outil utile pour étudier divers processus biologiques, en particulier les maladies neurodégénératives humaines. Cependant, la quantification manuelle des phénotypes de l’œil rugueux peut être biaisée et peu fiable. Nous décrivons ici une méthode par laquelle ilastik et Flynotyper sont utilisés pour quantifier le phénotype oculaire de manière non biaisée.

Quantification des phénotypes oculaires de Drosophila melanogaster : une approche computationnelle intégrant ilastik et Flynotyper

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Découvrez un protocole d'imagerie à haute résolution et peu coûteux pour quantifier les défauts de croissance et de structure des yeux de Drosophila adulte. Cette méthode accessible remplace la microscopie électronique à balayage.

Un flux de travail simple et rapide pour la quantification des structures externes de la drosophile adulte

Explorer plus de vidéos