Name: Systèmes de modèles de tissus organotypiques pour l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez l'utilisation de modèles tissulaires organotypiques pour étudier les interactions hôte-pathogène in vitro. Cette méthode permet d'évaluer les réponses inflammatoires de l'épithélium oral aux biofilms microbiens.

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<table><tbody><tr><td>Disques d’hydroxyapatite (HA) de 13 mm</td><td>Plasma Biotal Limited</td><td>n/a (sur commande)</td><td>Substrat pour la formation d’un biofilm buccal, imitant la surface de la dent</td></tr><tr><td>Aiguille de 19 G (40 mm)&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>613-2028</td><td>Utilisé pour aider à l’élimination des disques HA des plaques et pour découper les tissus des inserts</td></tr><tr><td>24 plaques de microtitrage à fond plat bien traitées TC avec couvercles&nbsp ;</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>3524 (paquet de 100)</td><td>Plaques pour la culture de biofilms et les expériences de co-culture tissulaire</td></tr><tr><td>Perles de verre lavées à l’acide (425-600 &mu ; m)</td><td>Merck : Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Pour la lyse tissulaire afin d’améliorer le rendement de l’extraction de l’ARN. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Actinomyces naeslundii DSM 17233&nbsp ;</td><td>Institut Leibniz DSMZ</td><td>n/a</td><td>L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm</td></tr><tr><td>Bead Mill 24 Homogénéisateur (ou équivalent)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>Pour la lyse tissulaire afin d’améliorer le rendement de l’extraction de l’ARN. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Bijoux&nbsp ; (7 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>189170 (700 par sac)</td><td>Utilisé pour la sonication du biofilm&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc (haute capacité)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814 (pour 200 réactions)</td><td>Synthèse d’ADNc à partir de l’ARN tissulaire</td></tr> Base de <tr><td>gélose au sang de Columbia (CBA)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CM0331B (pour 500 grammes)</td><td>Utilisé pour préparer des plaques CBA pour la culture de micro-organismes aérobies</td></tr><tr><td>Défibriné Sang de cheval</td><td>E& O Laboratories</td><td>DHB</td><td>Utilisé pour compléter les plaques CBA et FAA pour la culture de micro-organismes aérobies et anaérobies</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (dPBS : sans CaCl2 et MgCl2)</td><td>Merck : Sigma-Aldrich</td><td>DB537</td><td>dPBS pour la co-culture cellulaire avec le sonicate de biofilm</td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum ATCC 10953</td><td>American Type Culture Collection</td><td>n/a</td><td>L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm</td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507</td><td>Institut Leibniz DSMZ</td><td>n/a</td><td>L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm</td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Version 10)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>n/a</td><td>Pour la création de graphiques et l’analyse de données&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit ELISA IL-8 humain (kit ELISA non revêtu avec plaques)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>88-8086-86 (pour tests 10 x 96)</td><td>Kit ELISA et plaques pour l’évaluation des protéines des milieux tissulaires épuisés</td></tr><tr><td>Épithélium oral humain (HOE)&nbsp ;</td><td>Episkin</td><td>n/a (fabriqué sur commande)</td><td>Le tissu épithélial utilisé pour le système de modèle de co-culture</td></tr><tr><td>Boucles d’inoculation (jetables, 10 & micro ; L, ou équivalent)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12870155 (paquet de 1000)</td><td>Pour la culture microbiologique en milieux solides et liquides</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Reaction Plaques qPCR à 96 puits (0,1 mL)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907 (pour 10 plaques)</td><td>Pour le profilage de l’expression génique qPCR des tissus Billes de</td></tr><tr><td>microbanque</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170</td><td>Stockage et cyroconservation des micro-organismes&nbsp ;</td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9935 (10 x 1,5 mL)</td><td>Eau de qualité RT-PCR pour les expériences qPCR&nbsp ;</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (90 mm)</td><td>Fisher Scientific (Sterilin)&nbsp ;</td><td>11309283 (boîte de 500)</td><td>Utilisé pour la préparation de plaques de gélose pour la culture microbienne</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>18912014 (boîte de 100 comprimés)</td><td>PBS pour la standardisation des micro-organismes et les étapes de lavage du biofilm</td></tr><tr><td>Mini kit Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74106 (pour 250 réactions)</td><td>Kit d’extraction d’ARN sur colonne pour les tissus&nbsp ;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 moyen</td><td>Merck : Sigma-Aldrich</td><td>R7755-10L (pour 10 L)&nbsp ;</td><td>Supports pour la culture du biofilm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Réseau de profileurs RT2</td><td>Qiagen</td><td>330171 (sur mesure)</td><td>Réseau qPCR contenant des amorces prêtes à l’emploi pour le profilage de l’expression génique</td></tr> Base de <tr><td>gélose anaérobie Schaedler</td><td>Merck : Sigma-Aldrich (Millipore)</td><td>91019 (pour 500 g)</td><td>Utilisé pour préparer des plaques de gélose anaérobie Fastdious&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bouillon anaérobie Schaedler</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>CM0497B (pour 500 g)</td><td>Milieu liquide pour la croissance de micro-organismes anaérobies</td></tr><tr><td>Bouchon à vis Beadbug O-Ring tube&nbsp ;</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>Z763837-1000EA (paquet de 1000)</td><td>Pour une utilisation dans l’homogénéisateur Bead Mill 24, pour lyser les tissus</td></tr><tr><td>Bain de sonication</td><td>Fisher Scientific (Fisherbrand)</td><td>n/a</td><td>Pour la sonication de biofilms à partir de disques HA&nbsp ;</td></tr><tr><td>Streptococcus intermedius DSM 20753&nbsp ;</td><td>Institut Leibniz DSMZ</td><td>n/a</td><td>L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle de biofilm complexe</td></tr><tr><td>Streptococcus mitis NCTC 12261</td><td>Collection nationale de cultures types</td><td>n/a</td><td>L’un des microorganismes utilisés pour le modèle de biofilm complexe</td></tr><tr><td>Streptococcus oralis NTCC 11427&nbsp ;</td><td>Collection nationale de cultures types</td><td>n/a</td><td>L’un des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm</td></tr><tr><td>SYBR-green (qPCRBIO, SyGreen Mix, Hi-ROX)</td><td>PCR Biosystems</td><td>PB20.12</td><td>SYBR-green mix pour qPCR&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bouillon Todd Hewitt</td><td>Merck : Sigma-Aldrich</td><td>T1438&nbsp ;</td><td>Supports pour la culture du biofilm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptone (TSB) moyen</td><td>Merck : Sigma-Aldrich</td><td>22092 (pour 500 g)</td><td>Milieu liquide pour la croissance de micro-organismes aérobies</td></tr><tr><td>Pince à épiler (150 mm, acier inoxydable, dentelée)</td><td>RS-Pro&nbsp ;</td><td>545-187</td><td>Utilisé pour déplacer des disques d’AH et des inserts tissulaires/extraits de tissus</td></tr><tr><td>Tubes universels&nbsp ; (30 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>201150 (400 par sac)</td><td>Récipients pour la culture de micro-organismes en culture liquide&nbsp ;</td></tr><tr><td>Veillonella dispar NCTC 11831</td><td>National Collection of Type Cultures</td><td>n/a’L’un</td> <td>des micro-organismes utilisés pour le modèle complexe de biofilm</td></tr><tr><td>&bêta ;-métacapthoéthanol</td><td>Merck : Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Désactivation de la RNase dans des échantillons de tissus</td></tr></tbody></table>

systèmes de modèles de tissus organotypiques pour l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Dans cette expérience, HOE a été exposé à 7 espèces de biofilm contenant du sonicate, organisme représentatif du passage de la santé bucco-dentaire à l’inflammation des gencives (connue sous le nom de gingivite). Cette maladie résulte d’une inflammation du tissu épithélial gingival ou buccal due à des perturbations microbiennes dues à l’accumulation de plaque dentaire à la surface de la dent. Après la stimulation, les tissus et les milieux usagés sont utilisés pour les analyses transcriptionnelles et protéomiques, comme indiqué ci-dessus. Pour cette expérience, l’expression génique d’un panel de biomarqueurs inflammatoires a été détectée dans le tissu post-stimulation avec du biofilm sonicate (Figure 2). Cela a été réalisé en utilisant un réseau de profileurs PCR RT2 sur mesure contenant 16 gènes différents, et l’expression génique a été démontrée comme un changement de pli par rapport au tissu non stimulé après normalisation au gène d’entretien GAPDH. La stimulation microbienne a augmenté l’expression de tous les gènes à l’exception de CXCL5, avec des différences statistiques observées pour NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF1A, IL1B et TLR4 (Figure 2A). Le changement de pliage le plus important a été observé pour CCL2, CXCL1 et CSF3, avec des augmentations de 16,9, 10,3 et 15,1, respectivement (figure 2B).
Des milieux HOE usagés ont été utilisés pour des analyses protéomiques afin de détecter les protéines produites et libérées par le tissu après stimulation. Ceci est utile pour déterminer si l’expression des gènes est corrélée à la production de protéines. Pour ce faire, l’expression du gène IL8 et la libération de la protéine IL-8 ont été évaluées dans des tissus témoins et des tissus stimulés par le biofilm-sonicate (Figure 3). L’expression génique a été évaluée à l’aide de la qPCR basée sur SYBR-green avec des amorces pour l’IL8 et le GAPDH, comme décrit précédemment3. L’expression de l’ARNm IL8 dans HOE a été multipliée par 8,67 après stimulation avec du sonicate de biofilm (Figure 3A). Au niveau des protéines, les niveaux d’IL-8 ont été quantifiés à l’aide d’un kit ELISA d’IL-8. La concentration d’IL-8 dans les milieux usés a été augmentée, passant de ~1,005 ng/mL dans le tissu témoin à ~4,245 ng/mL dans le tissu stimulé par le biofilm-sonicate (figure 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig01.jpg"> 
Figure 1 : Différentes applications des modèles de co-culture de tissus organotypiques. Des suspensions normalisées de micro-organismes sont appliquées directement sur le tissu pour étudier les interactions espèces-hôtes (A). Ceux-ci sont souvent utilisés pour évaluer la colonisation microbienne sur une courte période de temps (p. ex., &lt;24 h). Des biofilms complexes sont soniqués pour étudier les effets des cellules dispersées ou des agrégats de biofilms sur les tissus (B). Ceci est important car il a déjà été démontré que ces cellules ont des phénotypes uniques par rapport à leurs homologues planctoniques ou à biofilm ; à cette fin, des biofilms intacts peuvent être ajoutés directement aux tissus à l’aide d’inserts supplémentaires plus petits pour créer une exposition adjacente avec l’hôte (C). Enfin, des cellules planctoniques sont ajoutées aux tissus dans des milieux de culture appropriés pour évaluer la colonisation microbienne, la formation de biofilms et la dynamique de croissance sur le tissu (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig02.jpg"> 
Figure 2 : Expression génique du tissu HOE après stimulation avec du biofilm sonicate de 7 espèces. Changement de pli d’expression de l’ARNm d’un total de 15 gènes inflammatoires normalisés au gène d’entretien, GAPDH, dans des échantillons de tissu HOE contrôlés, non stimulés et exposés à 100 μL de sonicate de biofilm de 7 espèces (A). Les trois gènes (CCL2, CXCL1, CSF3) présentant les changements les plus élevés dans l’expression de l’ARNm sont représentés en (B). Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un test T paramétrique non apparié, les changements significatifs étant *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 et ***p &lt; 0,001, respectivement. Les données ont été tracées et analysées à l’aide de logiciels statistiques et graphiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig03.jpg"> 
Figure 3 : Expression du gène IL8 et niveaux de protéine IL-8 produits par le tissu HOE. Changement du repliement de l’expression de l’ARNm de l’IL8 dans le tissu HOE, déterminé par qPCR (A) basé sur SYBR-green et les niveaux de protéine IL-8 quantifiés à partir de milieux tissulaires usagés à l’aide de la méthodologie ELISA (B). Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un test T paramétrique non apparié, les changements significatifs étant *p &lt; 0,05 et ****p &lt; 0,0001, respectivement. Les données ont été tracées et analysées à l’aide de logiciels statistiques et graphiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Systèmes de modèles de tissus organotypiques pour l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Découvrez l'utilisation de modèles tissulaires organotypiques pour étudier les interactions hôte-pathogène in vitro. Cette méthode permet d'évaluer les réponses inflammatoires de l'épithélium oral aux biofilms microbiens.

Systèmes de modèles de tissus organotypiques pour l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène

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