Systèmes de modèles de tissus organotypiques pour l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène

Les biofilms plats dentaires sont composés de centaines de micro-organismes qui peuvent entraîner une inflammation de leur épithélium buccal, entraînant des maladies telles que la gingivite. Nous voulons mieux comprendre ces interactions, à l’aide de modèles de tissus organotypiques. Ces systèmes fournissent des plates-formes utiles pour évaluer de manière contrôlée les modalités de traitement alternatives.

Ainsi, les progrès des technologies de séquençage au cours des dernières années transforment le domaine de la biologie des infections. Ces technologies nous permettent d’étudier véritablement les interactions hôte-pathogène, en utilisant plusieurs techniques OMICs grâce à l’évaluation des signatures de l’hôte et microbiennes aux niveaux protéomique, transcriptomique et métabolomique. Nos recherches récentes ont mis en évidence l’importance des interactions inter-règnes et polymicrobiennes dans les infections liées au biofilm.

Grâce à l’utilisation de systèmes modèles in vitro, nous avons été en mesure d’étudier les interactions entre les biofilms de l’hôte, de tester de nouvelles thérapies anti-biofilms et de profiler les communautés microbiennes, en utilisant des technologies innovantes telles que la RAM et la spectroscopie. Des études futures, utilisant ces modèles de tissus organotypiques, viseront à obtenir une signature et un profilage multi-OMIC du micro-organisme et du tissu et de la culture de l’hôte, ensemble. Nous espérons découvrir et démêler des interactions complexes entre l’hôte et des bactéries et des espèces fongiques spécifiques dans nos modèles de biofilm.

Pour commencer, retirez les tiges gelées de billes poreuses contenant des espèces de streptocoques à partir de 80 degrés Celsius. Faire revivre les espèces de streptocoques sur des plaques de base de tarière à sang Columbia, contenant 5 % de sang de cheval défibriné stérile. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Le lendemain, transférez trois à quatre colonies de l’assiette dans 10 millilitres de bouillon de soja tryptone. Cultivez le bouillon à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 16 à 18 heures. Après l’incubation, centrifuger les suspensions cellulaires à 3 000 G pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius.

Lavez les granulés de cellules avec 10 millilitres de PBS stérile. Remettez les pastilles en suspension dans 10 millilitres de PBS et normalisez la suspension de chaque espèce de streptocoque, individuellement, à l’aide d’un spectrophotomètre réglé à 550 nanomètres. Après la normalisation, diluer chaque suspension de streptocoque, de un à 10, pour atteindre une concentration de un fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre dans un mélange un à un de bouillon Todd Hewitt et de milieu du Roswell Park Memorial Institute.

Pipeter 500 microlitres de suspensions cellulaires diluées dans une plaque de microtitration de 24 puits, contenant un disque d’hydroxyapatite de 13 millimètres. Incuber la culture pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour permettre la formation de biofilm. De la même manière, culture de micro-organismes anaérobies sur une base de tarière anaérobie exigeante, contenant 5 % de sang de cheval défibriné stérile.

Standardisez chaque micro-organisme anaérobie à une absorbance spécifique et diluez-les dans un mélange individuel de bouillon Todd Hewitt et de milieu du Roswell Park Memorial Institute. Après la maturation du biofilm du streptocoque, retirez soigneusement les cellules non adhérentes et les milieux usés des puits. Ajoutez 500 microlitres de un fois 10 standardisé à la puissance sept cellules par millilitre de suspensions de quatre micro-organismes anaérobies dans chaque puits.

Incuber les biofilms pendant 24 heures dans des conditions anaérobies à 37 degrés Celsius. Le lendemain, retirez les cellules non collées et les milieux usagés des puits. Ajouter 500 microlitres de mélange stérile un à un de bouillon Todd Hewitt et de milieu du Roswell Park Memorial Institute.

Cultivez les biofilms dans des conditions anaérobies pendant 24 heures. Le septième jour, lavez les biofilms deux fois avec 500 microlitres de PBS stérile pour la co-culture. Pour commencer, déballez et transférez l’épithélium buccal humain ou le tissu et le milieu HOE dans une enceinte de sécurité de classe deux.

Ajouter un millilitre de milieu d’entretien fourni avec le tissu dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. À l’aide d’une pince à épiler stérile, retirez les inserts en polycarbonate contenant le tissu HOE de la vis sans fin et de la plaque d’expédition à 24 puits. Transférez le tissu dans la plaque à 12 puits préparée.

Incuber les modèles de tissus pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pour les acclimater aux conditions de laboratoire. Pendant ce temps, pour retirer les biofilms des disques d’hydroxyapatite, utilisez une aiguille de calibre 19 et une pince à épiler pour soulever les disques du fond de la plaque à 24 puits. Transférez les disques dans un bijou contenant un millilitre de DPBS stérile.

Soniquez les disques à 35 kilohertz pendant 10 minutes dans un bain d’eau de sonication. Après l’acclimatation, utilisez une pince à épiler pour retirer les inserts de tissu de la plaque à 12 puits. Pipette 100 microlitres de la suspension de biofilm sonicate directement sur les modèles de tissus.

Transférez les inserts sur une autre plaque à 12 puits contenant un millilitre de milieu d’entretien frais. Incuber les modèles de tissus pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pour le traitement des tissus, préparez 350 microlitres de tampon de lyse RLT, contenant 1 % de mercaptoéthanol dans un tube torique à bouchon à vis de deux millilitres.

Ajoutez environ 100 microlitres de billes de verre lavé à l’acide de 0,5 millimètre dans le tube. À l’aide d’une pince à épiler, retirez les inserts contenant le tissu du milieu et jetez toute suspension microbienne restante de l’insert. Tenez l’insert à l’envers au niveau des yeux, puis utilisez une aiguille de calibre 19 pour trancher soigneusement le tissu et la membrane du bas de l’insert.

Transférez le tissu et la membrane dans le tampon RLT préparé. Homogénéisez le tissu pendant 30 secondes à l’aide d’un homogénéisateur de perles de paillasse. Extrayez l’ARN du lysat obtenu, en suivant les instructions du kit d’extraction d’ARN du fabricant.

Prélever les milieux tissulaires usagés restants pour des analyses protéomiques, en utilisant des méthodologies à faible et à haut débit. L’expression génique des biomarqueurs inflammatoires dans le tissu HOE a été significativement régulée à la hausse après l’exposition au biofilm sonicate, par rapport au témoin non stimulé. Les changements de pliage les plus importants ont été observés pour CCL2, CXCL1 et CSF3.

L’expression de l’ARNm IL8 dans le tissu HOE a été multipliée par 8,67, après stimulation avec du sonicate de biofilm, par rapport au tissu contrôlé. Les niveaux de protéine IL8 dans les milieux épuisés ont été augmentés de 1,005 nanogramme par millilitre dans le tissu témoin à 4,245 nanogrammes par millilitre dans le tissu stimulé par le biofilm sonicate.