Name: Préparation de balles pistolet à gènes et transfection biolistique des neurones en culture Slice (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Découvrez la préparation de balles pistolet à gènes et la transfection biolistique de neurones dans des coupes d'hippocampe de rat. Cette technique permet une visualisation efficace de neurones individuels sur fond propre.

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Nous tenons à remercier Mark Lucanic et Hwai-Jong Cheng de l&#39;aide pour l&#39;acquisition des images faible grossissement des coupes d&#39;hippocampe ensemble présenté dans cette vidéo. Nous tenons également à remercier Sarah Parrish pour avoir aidé avec le texte qui accompagne la vidéo.

PROTOCOLE POUR LA TRANSFECTION biolistique Faire des balles Les puces sont bonnes pour un maximum de 6 mois, mais peut commencer à diminuer dans l&#39;efficacité de transfection après 2-3 mois. Bullets doivent être conservés à 4 ° C en présence de boulettes de dessicant. Toujours laisser les flacons à scintillation, dans lequel sont stockées les balles, le réchauffer à température ambiante avant d&#39;ouvrir le flacon. Avant de commencer avoir en main: <ul><li> Spermidine (0,05 M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100% de haute qualité-non ouvert bouteille) </li><li> Autoclavés H 2 0 </li><li> ADN à transfecter </li><li> Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 mg / ml de stock) </li><li> 2 X 15 ml conique (2/bullet jeu) </li><li> Tubes (coupé en 1 X ~ 30 pouces jeu balle /) </li><li> Fioles à scintillation (ensemble 1/bullet) </li><li> Granulés dessiccation </li><li> Seringue de 10 ml w / tube à l&#39;extrémité </li></ul> Préparer tube: <ol><li> Dry ~ 30 pouces de tubes (environ 2 pouces au-delà droite O-ring) dans la station de tube w / gaz N 2 (0,4 pression) pour une durée minimale de 20 min. </li></ol> Précipiter l&#39;ADN sur des billes d&#39;or: <ol><li> Préparer l&#39;ADN à transfecter dans 50 volume total μmL en microtube (maximum 50 mg d&#39;ADN total) </li><li> Peser 6-8 mg d&#39;or et de transfert à un microtube </li><li> Ajouter 100 ul de 0,05 M spermidine d&#39;or et une sonication pendant 20 sec </li><li> Ajoutez les 50 uL d&#39;ADN pour la médaille d&#39;or / spermidine </li><li> Vortex (autour de la mise 5) W / CAP ouverte </li><li> Ajouter goutte à goutte 100 ul de CaCl 2 1M </li><li> Brièvement Soniquer (&lt;5 sec) </li><li> Laisser décanter pendant 10 min à température ambiante </li><li> Soniquer brièvement </li></ol> Préparer la solution PVP pendant la sonication: <ol><li> Faire diluer solution PVP dans 15 ml conique, 3,5 ml diluées PVP pour chaque jeu de balles (ajouter 7,5 ul de 20mg/ml PVP stock à 3,5 ml EtOH 100%) </li></ol> Rinçage des billes d&#39;or avec EtOH: <ol><li> Isoler perles d&#39;or à pleine vitesse pendant 10 secondes dans la microcentrifugeuse </li><li> Rejeter le surnageant, mais gardez une petite quantité de liquide sur le dessus de perles d&#39;or </li><li> Laver avec 1 ml EtOH 3X, soniquer brièvement chaque fois, si nécessaire </li></ol> Or Resuspendre / ADN en solution PVP: <ol><li> Reprendre le culot d&#39;or dans 200 ul de la diluer 3,5 ml PVP / EtOH solution </li><li> Vortex le culot d&#39;or pour resuspendre (brièvement soniquer si nécessaire) </li><li> Transférer la uL 200 de l&#39;or / solution de PVP à une nouvelle conique 15 ml </li><li> Continuer de cette manière, l&#39;ajout de 200 uL de PVP à un moment jusqu&#39;à ce que tous l&#39;or a été transféré à la forme conique de 15 ml, et le volume final est de 3,2 ml </li></ol> Tube de revêtement: <ol><li> Éteignez N 2 à la station de tuyaux et tubes en retirer séchées </li><li> Fixez tube séché à la seringue de 10 ml </li><li> Secouez vigoureusement les 15 ml conique rempli d&#39;or / PVP </li><li> Placez l&#39;extrémité du tuyau en or / solution de PVP et sucer lentement en prenant soin d&#39;éviter les bulles </li><li> Laisser ~ 2 pouces à sec des deux extrémités de la tuyauterie </li><li> Avec le tube encore attaché à la seringue et rempli de la solution d&#39;or / PVP, placer soigneusement le dos tube dans la station </li><li> Marquer les extrémités du tube où la solution se trouve </li><li> Laissez l&#39;or se contenter de 5 min avec la seringue fixée </li><li> Suce-place de la solution très lentement en tirant la seringue afin que l&#39;or réglée soit laissé (veillez à ne pas revenir de lavage) </li><li> Déconnecter la seringue </li><li> Rotation de 90 ° et laisser reposer 2 secondes </li><li> Rotation de 180 ° et laisser reposer encore 2 secondes </li><li> Tournez le tube pendant 5 secondes </li><li> Allumez le N 2 de sorte que la vanne lit entre 0,4 à 0,5 et le spin du tube recouvert d&#39;or pendant le séchage pendant 5 min. </li></ol> Coupe tube: <ol><li> Retirez le tube de la tubulure de préparation en station et couper les extrémités à la marque. </li><li> Mettez un flacon à scintillation étiqueté sous le couperet tuyau pour attraper cartouches coupé </li><li> Placer dans le tube chopper tube et couper le tube avec de rasoir propre </li><li> Placer un dessèchement granulés en flacon à scintillation </li><li> Conservez les cartouches à 4 ° C </li></ol> Tir des tranches de tissu Lorsque vous photographiez des tranches de culture, il est important d&#39;employer une technique relativement stérile afin d&#39;éviter toute contamination. Rappelez-vous que lorsque vous photographiez deux constructions différentes, les deux séries de balles peuvent être chargées dans le support de la cartouche même, mais le canon-liner et l&#39;écran doit être changé entre les constructions. Avant de commencer avoir en main: <ul><li> Balles ADN (laissez flacon à scintillation se réchauffer à température ambiante avant ouverture) </li><li> Tranches de tissu </li><li> Helios pistolet à gènes </li><li> Réservoir d&#39;hélium avec un tuyau pistolet à gènes attachés &lt;/ Li&gt; <li> Support de la cartouche </li><li> Liner baril de plastique joint torique en place </li><li> Diffuseur (modifié) </li><li> Écran diffuseur </li><li> Forceps </li></ul> Prepping le pistolet génique: <ol><li> En utilisant une pince placer les cartouches en or recouvert de plastique dans le support de la cartouche. </li><li> Placez le support de la cartouche dans le pistolet à gènes d&#39;abord repousser verrouillage </li><li> Fixez le support de la cartouche avec blocage </li><li> Obtenir une doublure canon avec un joint torique et l&#39;écran diffuseur solidement en place </li><li> Vissez le baril-liner dans le pistolet à gènes </li></ol> Tir tranches cultivés avec le pistolet à gènes: <ol><li> Mettez cache-oreilles </li><li> Branchez le pistolet à gènes dans le tuyau de gaz réservoir relié Hélium </li><li> Tournez la pression sur le réservoir à 180 PSI </li><li> Tirez une vierge dans l&#39;air afin d&#39;enlever toute la poussière ou les débris de l&#39;écran diffuseur. Pour tirer le canon, d&#39;abord appuyer sur le bouton de verrouillage de sécurité jusqu&#39;à ce que les bips fusil, puis tirez sur la gâchette. </li><li> Après le tournage de la vierge, retirez les tranches de l&#39;incubateur </li><li> Avance au pistolet d&#39;abord construire </li><li> Shoot avec l&#39;écran diffuseur d&#39;environ 0,5 - 1 pouce de la tranche </li><li> Advance de la cartouche entre les puits. </li><li> Après le tournage du dernier puits, placer les tranches de retour dans l&#39;incubateur </li><li> Éteignez la pression du gaz et la libération avant de détacher le pistolet du tuyau d&#39;hélium </li><li> Dévissez la doublure baril, et retirez la cartouche et les coquilles utilisées </li></ol> Nettoyage porte-cartouches et les doublures canon: <ol><li> Placez les cartouches, les doublures baril, et les écrans de diffuseur dans un bécher avec de l&#39;eau savonneuse </li><li> Bécher place dans sonicateur de bain et une sonication pendant 20 min </li><li> Rincer abondamment à l&#39;eau jusqu&#39;à ce que tous les résidus de savon sont retirés </li><li> Faire tremper dans EtOH à 70% pour une heure </li><li> Placez-le sur une serviette en papier sèche sécher une nuit </li><li> Nettoyer les cartouches, les doublures baril, et les écrans peuvent ensuite être réutilisées dans les prochains transfections biolistique </li></ol> Conseils de dépannage pour la transfection biolistique Transfection biolistique peut parfois aboutir à des conditions de transfection optimales. Elle peut conduire à trop peu ou trop grand nombre de cellules transfectées, trop haut ou trop bas niveaux d&#39;expression, ou peuvent causer des tranches de tissu pour devenir généralement malsain. Entraînent souvent malsaine tranches de l&#39;explosion de pression. Voici quelques conseils pour obtenir des tranches de tissu de façon optimale transfectées. Si les tranches semblent être malsaine (ou si trop de cellules sont transfectées / tranche), essayez: <ul><li> distance de tir augmente </li><li> la pression diminue sur le réservoir de gaz </li><li> diminuant la quantité d&#39;or </li><li> découper le centre du diffuseur de Bio-Rad et le remplacement du centre avec un écran diffuseur. </li></ul> Si trop peu de cellules sont transfectées, essayez: <ul><li> diminuant la distance de tir </li><li> une pression croissante sur le réservoir de gaz </li><li> augmentant la quantité d&#39;or </li><li> augmentant le nombre de tranches de tissu / puits </li><li> assurez-vous que le joint torique dans le canon-liner est intacte. </li></ul> Si vous obtenez des tranches à la fois avec trop de cellules transfectées et trop peu pendant le tournage même s&#39;assurer que: <ul><li> que vous tenez le pistolet symétriquement au-dessus ainsi </li><li> que l&#39;or est uniformément revêtement de l&#39;intérieur du tube. (Si vous avez trouvé une ligne d&#39;or, d&#39;en tirer le surnageant du tube à un rythme plus rapide une fois l&#39;or s&#39;est installé et tourner l&#39;or plus avant de tourner sur l&#39;azote. Si, d&#39;autre part, vous avez trouvé des stries d&#39;or , cela est probablement attribuable à une exposition trop d&#39;humidité pendant la fabrication de puce: assurez-vous que vous utilisez un flacon non ouvert d&#39;EtOH, que le tube est bien sec avant de revêtement, et que vous le plafonnement des couvercles et des balles en préparation en temps opportun). </li></ul> Si l&#39;efficacité de transfection semble optimal (# des cellules transfectées / tranche), mais le niveau d&#39;expression semble trop haute ou trop basse: <ul><li> ajuster le ratio de l&#39;ADN à l&#39;or. (Par exemple, si elle est trop faible maintenir la quantité d&#39;or, mais augmenter la quantité d&#39;ADN.) </li><li> ajuster la quantité de temps entre les tirs et la collecte des données </li></ul> Dans le cas de la transfection double, si vous avez trouvé l&#39;expression trop peu de l&#39;un de vos constructions, d&#39;ajuster le ratio de ces deux concepts de façon appropriée et assurez-vous que les deux constructions sont sous le même promoteur, afin de s&#39;assurer que l&#39;on promoteur ne sera pas hors-compétition de l&#39;autre.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Transfection biolistique est un moyen physique de transfecter des cellules par l&#39;intermédiaire bombardement de tissus vivants avec des particules de haute vitesse de l&#39;ADN d&#39;or enrobées. Dans le transfert de gène médié particules, en général, les cellules transfectées résultat quand la balle vient reposer dans le noyau. Alors que de nombreuses méthodes de transfection différentes existent, telles que la microinjection, la lipofection, la transfection de phosphate de calcium, l&#39;électroporation et la transfection virale, la transfection biolistique peut offrir un moins de travail, et alternative efficace pour transfecter des cellules qui ne sont pas facilement transfectées en utilisant ces autres méthodes. En fait, il a d&#39;abord été développé comme une technique de transfert de gènes dans les plantes, car la présence de la paroi cellulaire faite de transfection difficile en utilisant des méthodes préexistantes 1. De même, biolistique a gagné en popularité dans le domaine de la neurobiologie depuis neurones post-mitotiques sont notoirement difficiles à transfecter 2,3. En particulier, il est largement reconnu comme principe de la technique pour être utilisés dans des expériences visant à évaluer la morphologie fine de neurones isolés dans les tranches de cerveau intact. Les méthodes décrites ici fournissent une explication détaillée et exhaustive de la façon d&#39;effectuer la transfection biolistique des tranches de cerveau de culture en utilisant une main du gène-gun (le système Hélios Gene Gun; Bio-Rad). Transfection biolistique est devenu la méthode privilégiée pour la transfection de neurones en culture tranche, car il permet la transfection d&#39;un certain nombre de cellules éparses à travers la tranche du cerveau. De cette façon, les neurones individuels peuvent être examinés isolément. Comme cette technique est particulièrement bien adapté pour la transfection de neurones dans le cerveau tranche, il est souvent utilisé en conjonction avec deux microscopie biphotonique, puisque la visualisation 2-photons d&#39;excitation permet de cellules marquées par fluorescence profonde dans le tissu diffusion de la lumière 4. En effet, les images à fort grossissement de la seule neurones pyramidaux présentées tout au long de cette vidéo ont été capturées à l&#39;aide d&#39;une coutume microscope intégré au laser 2-photons numérisation. En conclusion, la transfection biolistique est un moyen efficace de transfecter des cellules individuelles dans le contexte d&#39;une forte densité de cellules environnantes, et comme tel s&#39;est avéré extrêmement utile pour l&#39;étiquetage fluorescence neurones individuels dans la culture tranche de neurones.

Bien que nous avons listé tous les produits séparément, il est plus économique d&#39;acheter &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, qui comprend tous les produits de Bio-Rad énumérés ci-dessus (cat # 165-2431).

préparation de balles pistolet à gènes et transfection biolistique des neurones en culture slice

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Transfection biolistique est un moyen physique de transfecter des cellules en bombardant avec des tissus de haute vitesse de l&#39;ADN des particules enrobées. Nous fournissons un protocole détaillé pour la transfection biolistique de coupes d&#39;hippocampe de rat, de la préparation initiale des balles revêtus d&#39;ADN à la fusillade finale de la culture organotypique utilisant un canon à gènes. Transfection pistolet à gènes est un moyen efficace et facile de transfecter des neurones et est particulièrement utile pour l&#39;étiquetage par fluorescence un petit nombre de cellules dans les tissus tranche. Dans cette vidéo, nous avons d&#39;abord un aperçu des étapes nécessaires à la couche de particules d&#39;or avec l&#39;ADN. Nous avons ensuite montrer comment tapissent l&#39;intérieur du tube en plastique avec des balles d&#39;or / ADN, et la façon de couper ce tuyau pour obtenir les cartouches en plastique pour les charger dans le pistolet à gènes. Enfin, nous effectuons la transfection biolistique des cultures rat tranche de l&#39;hippocampe, ce qui démontre la manipulation de l&#39;Bio-Rad Helios canon à gènes, et offrant des conseils de dépannage pour obtenir des tranches de tissu sain et optimal transfectées.

Nous décrivons une méthode pour la préparation de l&#39;ADN des balles d&#39;or revêtues et de démontrer l&#39;utilisation de ces balles à biolistically transfecter des neurones en culture des coupes d&#39;hippocampe.

Préparation de balles pistolet à gènes et transfection biolistique des neurones en culture Slice

La transfection biolistique est un moyen physique de transfecter des cellules en bombardant des tissus avec des particules revêtues d'ADN à haute vélocité. Nous fournissons un...

La transfection biotique ou par canon à gènes est un moyen physique de transfecter des cellules en bombardant les tissus avec des particules revêtues d'ADN à haute vitesse. Cette technique constitue un moyen efficace et simple de transfecter des neurones et est particulièrement utile pour transfecter uniquement un petit nombre de cellules dans une tranche de tissu. Par exemple, en microscopie fluorescente, pour des études visant à examiner la morphologie neuronale dans une tranche intacte.La transfection par Bic permet la visualisation de neurones individuels dans un fond propre constitué de cellules non transfectées. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour fabriquer des balles d'obus de transfert recouvertes d'ADN, puis réaliser une transfection par Bic sur des cultures organotypiques de tranches d'hippocampe. Bonjour, je suis Georgia Woods.Je suis étudiante diplômée dans le laboratoire de la Dre Karen Zito à l'Université de Californie à Davis. Aujourd'hui, je vais démontrer comment préparer des microprojectiles recouverts d'ADN et comment réaliser une transfection Bic sur des tranches hippocampiques de rat. Les étapes fondamentales de la transfection Bic consistent d'une part à recouvrir des particules d'or avec l'ADN à transfecter, puis à tapisser l'intérieur du tube en plastique avec cet or.Coupez le tube en cartouches pour les charger dans le pistolet à gènes et tirez sur le tissu à transfecter. Commençons donc. Avant d'être prêts à transfecter, nous devons d'abord préparer les microprojectiles revêtus d'ADN.Cela implique d'enduire des particules d'or de 1,6 micron avec le plasmide ADN à transfecter. Lors du tir, une particule d'or individuelle agira comme un projectile qui pénétrera la cellule, entraînant la transfection. Nous devons donc d'abord préparer l'ADN à transfecter.Idéalement, vous devez utiliser moins de 50 microgrammes d'ADN par jeu de microprojectiles, dans un volume total de 50 microlitres d'eau. Gardez à l'esprit que la quantité exacte d'ADN à utiliser doit être déterminée empiriquement pour chaque construction, en fonction du niveau d'expression optimal à obtenir. Maintenant que nous avons notre aliquot d'ADN, nous devons ajouter du spermidine aux billes d'or.Ajouter aux huit mg d'or préalablement pesés, cent microlitres de sperme, meine et soniquer. Environ 20 secondes. C'est du sperme.La méine est une polyamine qui porte une charge positive, ce qui permet aux électrodes en or de fixer l'ADN chargé négativement en interagissant avec le métal chargé positivement. Après la 22e sonication, ajoutez la solution d'ADN dans 50 microlitres d'eau sur l'or. Une fois l'ADN ajouté aux billes, effectuez un vortex tout en ajoutant 100 microlitres de chlorure de calcium goutte à goutte ; le chlorure de calcium provoque la précipitation de l'ADN.Après un bref vortex, laisser la solution précipiter pendant 10 minutes. Après la précipitation de 10 minutes, centrifuger l'ADN et l'or à vitesse maximale pendant 30 secondes dans une centrifugeuse de table ; après la 32e centrifugation à haute vitesse, prélever la majeure partie du surnageant à l'aide d'une pipette, mais éviter d'aspirer le culot d'or. À ce stade, j'élimine simplement tout ADN qui ne s'est pas précipité sur l'or.Les particules d'or sont ensuite lavées dans un millilitre d'éthanol absolument neuf et soniquées brièvement. Une fois que l'ADN précipite, il a tendance à provoquer l'agglutination de l'or. Une légère sonication permet de rompre ces agrégats d'or. Toutefois, faites attention à ne pas cisailler l'ADN par une sur-sonication.Les pastilles d'or sont centrifugées à nouveau et l'éthanol est éliminé par pipetage. Répétez le lavage à l'éthanol deux fois supplémentaires. Après le troisième lavage à l'éthanol, ajoutez 200 microlitres de la solution diluée de polyvinylpernone ou PVP et soumettez au sonicateur.Transférez brièvement l'or recouvert dans un cône de 15 mil contenant déjà 200 microlitres de solution diluée de PVP. Le PVP est un solvant qui provoque l'adhésion des particules d'or aux tubulures en plastique utilisées. À l'étape suivante, éliminez les traces de billes d'or restant dans le tube épipage en ajoutant 200 microlitres de PVP dans le tube épipage.Ensuite, agiter brièvement et transférer dans un tube conique de 15 ml. Répéter cette opération jusqu'à ce que tout l'or ait été transféré dans le tube conique de 15 ml. Transférer la solution restante de PVP afin que l'or soit maintenant resuspendu dans une solution de 3,2 ml de PVP dans l'éthanol.Maintenant, nous sommes prêts à enduire le tube en plastique qui servira à contenir les microprojectiles du canon à gènes lorsqu'ils seront chargés dans l'appareil. Maintenant que l'or est recouvert d'ADN, nous devons tapisser l'intérieur du tube en plastique avec les particules d'or. Ce tube en plastique revêtu d'or est ce qui sera effectivement inséré dans le tube du canon à gènes.Commencez par couper un morceau de tube de manière à ce qu'il dépasse d'environ deux pouces par rapport à l'anneau O. Une fois le tube placé dans la station de préparation des tubes, tournez la vanne de pression afin que le débitmètre indique environ 0,4. L'azote fournit une atmosphère sans eau pour sécher le tube ; laissez sécher le tube pendant environ 20 minutes.Il est préférable d'effectuer cette étape de séchage pendant que vous enduisez les microbilles d'or avec l'ADN, comme indiqué à l'étape précédente. Ainsi, le tube sera sec et prêt à être enduit une fois cette opération terminée. Préparez les microbilles d'or maintenant que le tube est sec et que l'or a été recouvert d'ADN.Éteignez la station N deux avant de remplir le tube avec votre solution d'or PVP et retirez le tube desséché de la station pour l'attacher à une seringue de 10 mil avant d'aspirer le PVP et l'or dans le tube. Agitez soigneusement la solution puis aspirez-la immédiatement dans le tube desséché, en évitant les bulles. Veillez également à ne pas aspirer la solution dans la seringue.Avec le tube maintenant rempli de la solution d'or PVP, replacer soigneusement le tube dans la station N deux. Laisser la solution se décanter pendant cinq minutes avec la seringue fixée, afin que les particules d'or sédimentent au fond du tube. Marquer les extrémités du tube à l'endroit où la solution s'est déposée.Une fois la solution déposée, une traînée d'or sera visible au fond du tube à l'aide de la seringue attachée. Retirer le surnageant très lentement, en veillant à ne pas provoquer de rétrolavage ni à déconnecter le tube. Nous devons maintenant faire tourner et sécher le tube afin d'assurer une adhésion uniforme de l'or sur toute la surface interne du tube.Tout d'abord, faites tourner le tube de 90 degrés. Attendez deux secondes. Ensuite, effectuez une rotation de 180 degrés et attendez encore deux secondes.Faites tourner pendant cinq secondes, puis allumez le N deux afin que le dispositif affiche une valeur comprise entre 0,4 et 0,5, et faites tourner pendant que le tube sèche pendant cinq minutes. Maintenant que les cinq minutes sont écoulées et que notre or est sec, nous devons découper le tube en cartouches pouvant être chargées dans le pistolet à gènes. Je vais maintenant couper le tube en sections d’environ un demi-pouce pour former les enveloppes, qui auront une taille appropriée pour être insérées dans le cylindre du pistolet à gènes.Pour collecter les coquilles, placez la bile de simulation d'étanchéité sous le coupe-tube, coupez le tube au niveau des marques, puis coupez le tube avec un rasoir propre. Placez le tube dans le hacheur à tube afin d'obtenir une longueur appropriée. Il suffit d'insérer le tube vers l'avant jusqu'à ce que vous rencontriez une résistance, puis effectuez la coupe.Une fois le tube coupé et récolté dans le flacon de scintillation, placer une pastille de dessiccation dans le flacon de scintillation. Les plombs sont efficaces jusqu'à six mois, mais après deux à trois mois, ils peuvent commencer à montrer une diminution de l'efficacité de transfection. Il est donc recommandé d'étiqueter le flacon avec le nom du construit et la date.Les microprojectiles peuvent être utilisés immédiatement après leur préparation ou stockés à quatre degrés Celsius. Si vous utilisez des microprojectiles stockés à quatre degrés Celsius, laissez le flacon de station atteindre la température ambiante pendant environ 15 minutes avant de l'ouvrir afin d'éviter que les microprojectiles n'absorbent de l'humidité. Nous sommes maintenant prêts à tirer les microprojectiles d'ADN à l'aide d'un canon à gènes.À présent que les microperles sont préparées, je suis prêt à transfecter réellement les cellules. J'utiliserai un canon à gènes BioRad Helios pour tirer sur des tranches d'hippocampe de rat incubées pendant cinq jours depuis leur dissection. Le canon à gènes sera relié à une bouteille d'oxygène. Lorsque le pistolet est déclenché, une courte impulsion de pression provenant du réservoir accélère les particules d'or vers la tranche. En général, lorsqu'une particule d'or se retrouve intégrée dans le noyau de la cellule, cette cellule devient transfectée.Étant donné que je réalise des coupes transversales de tranches cultivées, j'emploie une technique relativement stérile tout au long de la transfection par Bic afin d'éviter toute contamination. Une fois que les cartouches ont atteint la température ambiante, ouvrez le flacon de simulation et placez les cartouches en plastique recouvertes d'or dans le support de cartouche. Insérez ensuite le support de cartouche dans le canon à gènes en repoussant d'abord le verrou du cylindre.Le revêtement du canon doit maintenant être fixé à l'arme. Tout d'abord, vérifiez que le joint torique est bien en place dans le revêtement du canon et que l'écran diffuseur est bien fixé. L'écran a pour fonction de répartir la pression provenant du canon et conduit à la pulvérisation de l'or, assurant ainsi une dispersion plus uniforme de l'or dans le puits.Vissez complètement le manchon du canon dans le pistolet à gènes. Lorsque deux constructions différentes sont utilisées, les deux jeux de microprojectiles peuvent être chargés dans le même porte-cartouche, mais le manchon du canon et l'écran doivent être changés entre chaque construction. Le pistolet à gènes est désormais prêt à être raccordé à la source d'hélium.Branchez le lanceur de gènes au tuyau relié au réservoir de gaz d'hélium. Il doit s'emboîter en place et augmentez la pression du réservoir à 180 psi. Le lanceur est désormais prêt à tirer, mais portez d'abord une protection auditive et, afin d'éliminer toute poussière ou débris de l'écran diffuseur, effectuez un tir à blanc pour actionner le lanceur.Tout d'abord, appuyez sur le bouton de verrouillage de sécurité jusqu'à ce que le pistolet émette un bip, puis tirez sur la gâchette. Nous sommes maintenant prêts à tirer sur la tranche. Après avoir effectué le tir témoin, retirez les tranches de l'incubateur.Lors de nos dissections de l'hippocampe, nous plaçons quatre tranches par puits et les disposons de manière à former les coins d'un carré de deux centimètres de côté, près du centre de la membrane. Illuminez chaque puits avec l'écran diffuseur situé à environ un demi-pouce à un pouce de la tranche. Les cellules transfectées peuvent généralement être examinées entre un et cinq jours après, selon le construct. Une fois tous les puits tirés, éteignez le gaz et relâchez la pression avant de détacher l'arme du tuyau d'hélium. Retirez les cartouches et les douilles usagées. Dévissez le tube de canon ; les cartouches, les tubes de canon et les tamis peuvent être nettoyés en les plaçant dans un bain d'eau savonneuse et en effectuant un traitement au bain ultrasonore pendant 20 minutes, puis en les rinçant soigneusement à l'eau, en les faisant tremper dans de l'éthanol à 70 % pendant une heure, et enfin en les posant sur une serviette en papier sèche toute la nuit.Les cartouches et les écrans propres peuvent ensuite être réutilisés lors de transfections biotiques ultérieures. Examinons maintenant quelques résultats de transfection. Même pour une préparation standard de tranches d'hippocampe, l'efficacité de la transfection peut varier considérablement selon les microprojectiles et les tranches.En général, une efficacité de transfection relativement faible est souhaitable afin d'obtenir des neurones transfectés bien isolés. De plus, lorsque trop de cellules sont transfectées, l'état général de la tranche est compromis, même dans des conditions optimales. Habituellement, il y a moins de 20 cellules par tranche, mais souvent d'autres tranches dans le même puits finissent par contenir beaucoup plus de cellules.Les lames transfectées et les autres lames comporteront moins de cellules. Les incohérences de transfection entre les lames sont généralement dues au fait que le positionnement des lames par rapport au barillet n’était pas symétrique, ou que l’or n’était pas uniformément déposé autour du tube, mais concentré sur un seul côté. Si trop de cellules sont transfectées, essayez d’augmenter la distance de tir par rapport à l’échantillon, de réduire la pression de tir ou de diminuer la quantité d’or utilisée pour fabriquer les projectiles.Ici, vous pouvez observer un excellent exemple de neurone paramétalique transfecté. Sur cette cellule particulière, on peut voir un projectile en or intégré dans la cellule. Voici un agrandissement d'un neurone transfecté. Dans le CA1, parfois, le tir peut entraîner des tranches non viables.Des tranches souvent non viables résultent de l'explosion de pression. Le système de canon à gènes Helios est fourni avec un diffuseur comportant une croix métallique en son centre. Nous retirons la croix métallique intérieure et utilisons à la place un tamis métallique en remplacement de cette croix.Nous coupons simplement l'écran un peu plus grand que l'extrémité du manchon du canon et nous l'insérons entre l'extrémité du manchon et le diffuseur coupé. Nous avons constaté que cela améliore la santé des tranches. De plus, les conditions de tir optimales varient selon le type de préparation expérimentale ; afin d'optimiser différents types de préparations expérimentales, faites varier la pression du réservoir d'hélium et la distance de tir par rapport à l'échantillon.Enfin, si vous souhaitez utiliser des microbilles portant deux constructions différentes pour une double transfection, assurez-vous que les deux constructions sont sous le contrôle du même promoteur. Ainsi, un promoteur n'entrera pas en compétition avec l'autre. Je viens de vous montrer comment préparer les microbilles pour le transfert génique et comment transfecter des tranches d'hippocampe en utilisant la transfection BIC.Il s'agit d'une méthode extrêmement puissante pour réaliser des études morphologiques sur des neurones individuels pouvant être imagés en isolation. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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