Name: Optimisation de la réaction de transcription in vitro pour la production d’ARNm à l’aide de la surveillance chromatographique en ligne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Découvrez une méthode chromatographique rapide pour optimiser la transcription in vitro et surveiller en temps réel la production d'ARNm. Cette approche maximise le rendement à 25 g/L tout en réduisant les coûts et les impuretés.

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<ol><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nat Biotechnol. 40, 840-854 (2022).</li>
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<li>Pregeljc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yield+of+in+vitro+transcription+reaction+with+at-line+high+pressure+liquid+chromatography+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yield of in vitro transcription reaction with at-line high pressure liquid chromatography monitoring.</a> Biotechnol Bioeng. 120 (3), 737-747 (2023).</li>
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<li>Matuszczyk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+provides+valuable+process+insights+for+cell-derived+and+cellular+products%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy provides valuable process insights for cell-derived and cellular products.</a> Curr Opin Biotechnol. 81, 102937(2023).</li>
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<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+particle+as+an+RNA+adsorbent+for+facile+purification+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica particle as an RNA adsorbent for facile purification of in vitro-transcribed RNA.</a> Int J Mol Sci. 24 (15), 12408(2023).</li>
<li>Ziegenhals, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dsRNA+by-products+during+in+vitro+transcription+can+be+reduced+by+using+low+steady-state+levels+of+UTP%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP.</a> Front Mol Biosci. 10, 1291045(2023).</li>
<li>Höfer, K., Langejürgen, L. V., Jäschke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+aptamer-based+real-time+monitoring+of+enzymatic+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Universal aptamer-based real-time monitoring of enzymatic RNA synthesis.</a> J Am Chem Soc. 135 (37), 13692-13694 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; m Filtre à membrane PES, par ex. Sartolab BT 500</td><td>Sartorius</td><td>180E14---------E</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en plastique de 0,5 mL ; par ex. DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td></td></tr><tr><td>tubes en plastique de 1,5 mL ; par ex. DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>ATP Solution</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp ;</td><td></td><td></td>R1331T2</tr><tr><td>Glacière de paillasse -20 &deg ; </td><td>Colonne</td><td></td> analytique de 0,1 mL 114935 <td></td>marque</tr><tr><td>C PrimaS (2 & micro ; m)</td><td>Séparations Sartorius BIA</td><td>110.5118-2, 2 & micro ; m canaux</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Solution MEBEP BIOSCIENCE&nbsp ;</td><td></td><td></td>R3331T2</tr><tr><td>TNT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2 x 2H2O</td><td>Kemika&nbsp ;</td><td>par exemple 11368 08</td><td></td></tr><tr><td>GTP Solution</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp ;</td><td></td><td></td>R2331T2</tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>1.10110.1000</td><td></td></tr><tr><td>Flacon HPLC à haute récupération</td><td>Macherey-Nagel</td><td>702860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM 9530G</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre microvolume</td><td>Thermo Scientic</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>mRNA standard, mFix4, 4000 nt</td><td>Sartorius BIA Séparations</td><td>BIA-mFix4.1.1</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7 + 10 H2O</td><td>Sigma</td><td>S6422-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>PATfix plateforme analytique d’ARNm&nbsp ;</td><td>Sartorius BIA Séparations</td><td>PAT0021</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 100 &ndash ; 1000 &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>Référence 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 2 &ndash ; 10 &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>Référence 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 20 &ndash ; 200 &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>Référence 2</td><td></td></tr><tr><td>Pyrophosphatase</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp ;</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away Réactif de décontamination</td> Inhibiteur de <td>l’ARN 10328011</td><td></td>thermo <td>Scientic</td></tr><tr><td></td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp ;</td><td></td><td></td>RNK3501</tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>85558-5G</td><td></td></tr><tr><td>ARNm polymérase T7</td><td>MEBEP BIOSCIENCE</td><td>TR01</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Thermo Scientic</td><td>EPPE5382000.015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T6066-1KG</td><td></td></tr><tr><td>UTP Solution</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp ;</td><td></td><td></td>R5331T2</tr><tr><td>Bouchons de flacons</td><td>Macherey-Nagel</td><td>70245</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>V1900</td><td></td></tr></tbody></table>

optimisation de la réaction de transcription in vitro pour la production d’arnm à l’aide de la surveillance chromatographique en ligne

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

L’analyse chromatographique décrite dans ce protocole peut être utilisée soit pour l’optimisation de l’IVT, soit pour convertir une réaction IVT par lots en une réaction fed-batch (Figure 1).
Pour tester l’effet de différentes compositions de tampons sur la cinétique de la réaction IVT, trois réactions IVT différentes ont été mélangées selon le protocole écrit dans le tableau 2. Le tampon contenant du Tris, dont le pH a été ajusté avec du HCl, a été comparé au tampon Tris, où le pH a été ajusté avec de l’acide acétique. De plus, les deux tampons Tris ont été comparés au tampon HEPES, où le pH a été ajusté avec du NaOH. La composition de tous les tampons 1x IVT était de 40 mM de Tris/HEPES, 10 mM de DTT, 2 mM de spermidine et un pH de 7,9.
À partir de 100 μL de mélange de réactions IVT, 2 μL d’échantillon IVT ont été retirés de la réaction IVT et trempés avec 2 μL de 100 mM d’EDTA toutes les 15 minutes au cours de la première heure d’incubation, puis toutes les 30 minutes jusqu’à 180 minutes d’incubation. Le rendement final attendu de l’ARNm pour cette condition de réaction était de 15 mg/mL, ce qui signifie qu’une dilution de 2 fois due à l’extinction a été suivie d’une dilution de 400 fois dans le MPA+NaCl pour l’analyse. L’échantillon a été dilué 800 fois au total, ce qui signifie que même à une production de 15 mg/mL, la concentration d’ARNm chargée sur la colonne chromatographique analytique était toujours dans les concentrations de la courbe d’étalonnage.
Les zones NTP et ARNm à A260 ont été intégrées pour chaque échantillon individuel à chaque point temporel individuel (tx). Les aires ont ensuite été converties en concentrations pour l’ARNm, en utilisant la courbe d’étalonnage de l’ARNm et le pourcentage de consommation pour les NTP, en utilisant l’aire A260 des NTP à 0 min (t0) comme 100 % (voir l’équation ci-dessous).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67503/67503eq01.jpg" style="margin: auto;">
Les résultats peuvent être présentés sous forme de graphiques pour chaque réaction IVT individuelle, où le temps est indiqué sur l’axe des x et la concentration d’ARNm et les NTP restants sont indiqués sur l’axe des y (Figure 2A). Tous les IVT, c’est-à-dire les concentrations d’ARNm en fonction du temps, peuvent également être regroupés dans un graphique, et la cinétique de production d’ARNm peut être étudiée et les conditions optimales d’IVT sélectionnées (Figure 2B).
Pour l’expérience fed-batch, l’IVT a été mélangé comme indiqué dans le tableau 3. À partir de 300 μL de mélange réactionnel IVT, 2 μL d’échantillon IVT ont été retirés de la réaction IVT et trempés avec 2 μL de 100 mM d’EDTA toutes les 30 min. De plus, l’échantillon a été prélevé immédiatement après chaque ajout en vrac de NTP+MgCl2 . Une solution d’alimentation contenant 42,4 mM de chaque NTP et 152,5 mM de MgCl2 a été préparée à l’avance, et 106 μL de chaque 200 mM de NTP ont été mélangés avec 76,2 μL de 1 M de MgCl2. Un régime d’alimentation a été établi, où des bolus d’alimentation ont été ajoutés toutes les heures (à 60 min, 120 min, 180 min et 240 min d’incubation). Le régime d’alimentation est décrit dans le tableau 3 Les échantillons ont été analysés en temps quasi réel avec des analyses comme décrit pour la réaction IVT en vrac. Après 300 minutes de surveillance, la réaction IVT a été éteinte.
Les résultats peuvent être présentés comme la production restante de NTP/ARNm au cours de l’incubation. Étant donné que l’ajout d’un bolus dilue également la réaction IVT, la concentration d’ARNm dans l’IVT diminue à chaque ajout d’aliment (Figure 3A). L’augmentation de la masse d’ARNm peut également être mesurée et présentée par des facteurs de transcription (définis comme m: ARNm/md’ADNm), montrant une augmentation linéaire de la production d’ARNm au fil du temps (Figure 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig01.jpg"> 
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique (A) Représentation du flux de travail d’optimisation IVT avec analyse chromatographique en ligne, quantification des NTP et de l’ARNm. (B) Chromatogrammes représentatifs d’une réaction IVT par lots échantillonnés à (i) t0, (ii) point médian, (iii) points temporels de réaction finaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig02.jpg"> 
Figure 2 : Graphiques IVT par lots. (A) Graphique représentatif de la réaction IVT avec la production d’ARNm et la consommation de NTP sur l’axe des y. Plateau de concentration d’ARNm visible à 120 - 180 min d’incubation, en corrélation avec la consommation de NTP car le NTP limitant (ATP) est consommé à 120 min. (B) Graphique IVT montrant l’influence du tampon IVT sur la cinétique IVT. L’IVT contenant le tampon A (Tris + acide acétique) a montré la production d’ARNm la plus rapide, suivie du tampon B (Tris + HCl) et du tampon C (HEPES+NaOH) comme les plus lentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig03.jpg"> 
Figure 3 : Graphique IVT Fed-batch. (A) Graphique IVT où les alimentations NTP+MgCl2 ont été ajoutées à 60, 120, 180 et 240 min. La concentration d’ARNm dans la réaction IVT diminue à chaque ajout d’alimentation en raison de la dilution avec l’alimentation NTP+MgCl2. (B) L’augmentation de la masse d’ARNm montrée par le facteur de transcription est linéaire tout au long de l’incubation de la réaction. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Protocole IVT générique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Protocole IVT par lots. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3 : Protocole IVT Fed-batch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%203_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Optimisation de la réaction de transcription in vitro pour la production d’ARNm à l’aide de la surveillance chromatographique en ligne

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

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Optimisation de la réaction de transcription in vitro pour la production d’ARNm à l’aide de la surveillance chromatographique en ligne (Vidéo) | JoVE Journal

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