Évaluation de gènes anormaux liés à la croissance de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques en combinant la technologie CRISPR/Cas9 avec le comptage cellulaire

Le champ de la recherche est la pathogenèse de la leucémie. Notre objectif est d’identifier les gènes critiques pour la prolifération anormale des HSPC en les combinant avec CRISPR/Cas9 avec des tests CCK-8, révélant ainsi leur rôle dans la tumorogenèse et leur potentiel en tant que cibles médicamenteuses.

L’édition génomique basée sur CRISPR/Cas-9 offre une approche simple et efficace pour réaliser l’inactivation de gènes dans vos cellules eucaryotes. Le défi expérimental actuel consiste à augmenter encore l’efficacité de l’inactivation de CRISPR/Cas-9.

Notre protocole utilise des souris Cas-9 pour fournir aux cellules de la moelle osseuse l’expression consultative de Cas-9, ce qui permet à la transmission virale de SGI dans les cellules, améliorant ainsi considérablement l’efficacité expérimentale.

[Présentateur] Pour commencer, obtenez le fémur et le tibia de la souris expérimentale euthanasiée. Transférez le fémur et le tibia dans une hotte à flux laminaire immédiatement après l’enlèvement pour maintenir la stérilité. À l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre, rincer la cavité de la moelle osseuse avec du PBS contenant 2 % de FBS pour prélever les cellules de la moelle osseuse. Pipetez les cellules de la moelle osseuse de haut en bas 30 à 50 fois pour les disperser en cellules uniques. Transférez le mélange de cellules dans un tube de 50 millilitres et utilisez un vortex pour bien mélanger. Ajoutez 10 microlitres de suspension cellulaire à 40 microlitres de tampon de lyse érythrocytaire et placez-le sur de la glace pendant cinq minutes pour lyser les érythrocytes. Ajoutez ensuite 50 microlitres de solution bleue de Trypan. Mélangez bien et comptez les cellules viables. Ensuite, centrifugez les cellules à 800 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et aspirez le surnageant. Ensuite, remettez les cellules en suspension à une concentration d’une à deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre dans la moelle osseuse, milieu de pré-stimulation. Et grainez 10 millilitres de suspension dans un plat de 10 centimètres. Incuber le plat pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Pour recueillir les cellules pré-stimulées le lendemain, ajoutez cinq à 10 millilitres de PBS contenant 2 % de FBS et rincez vigoureusement la plaque. Transférez les cellules dans un tube frais et ajoutez du bleu de trypan dans les cellules. Comptez les cellules viables dans le mélange. Ensuite, centrifugez les cellules à 800 G pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans une solution de spinfection fraîchement préparée à une concentration d’environ 10 à la puissance six cellules par millilitre. Semez quatre millilitres de suspension dans chaque puits d’une plaque à six puits. Scellez la plaque avec du parafilm et centrifugez-la à 1 500 G pendant 90 minutes à 32 degrés Celsius. Après la centrifugation, remettre doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette sans changer de fluide. Incuber la plaque pendant quatre à six heures. Pour la première transfection, aspirez environ trois millilitres de milieu surnageant de chaque puits dans un tube et ajoutez un volume égal de milieu de pré-stimulation de la moelle osseuse. Si les cellules sont aspirées accidentellement, répétez les étapes de centrifugation et de remise en suspension comme décrit précédemment. Pour la transfection secondaire, le lendemain, prélever deux à trois millilitres de milieu de chaque puits et ajouter un volume égal de solution mère rétrovirale fraîchement décongelée avec des quantités appropriées d’hepas et de polygreen. Centrifugez la plaque à 1 500 G pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Après la centrifugation, remettez doucement les cellules en suspension et poursuivez l’incubation pendant quatre à six heures. Maintenant, remplacez le milieu comme décrit précédemment et incubez pendant 24 heures. Lavez la plaque avec du PBS contenant 2 % de FBS et récupérez les cellules. Filtrez les cellules à travers un tamis de 70 micromètres avant de compter les cellules viables à l’aide de bleu Trypan. Ensuite, centrifugez les cellules à 800 G pendant 10 minutes à température ambiante. Remettre en suspension les cellules dans du DMEM contenant 10 % de FBS et de l’interleukine-3, de l’interleukine-6 et du facteur de cellules souches murins. Centrifuger environ 0,5 à 1x10 à la puissance six cellules à 800 G pendant cinq minutes et jeter le surnageant. Conservez la pastille cellulaire à -80 degrés Celsius pour l’extraction de l’ADN génomique. Maintenant, ajoutez 1x10 à la puissance de quatre cellules par puits dans une plaque de 96 puits, ce qui fait six puits répliqués par groupe. Ajoutez ensuite 100 microlitres de PBS stérile dans les puits environnants et incubez jusqu’à différents points temporels de 0, 24, 48 et 72 heures. Aspirez le milieu à chaque point temporel et ajoutez 110 microlitres de milieu contenant 1/10e de volume de solution CCK-8 dans les puits. Incuber le mélange pendant une heure. Enfin, mesurez l’absorbance à 450 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. L’inactivation de Trp53 a considérablement augmenté la capacité proliférative des cellules souches de souris, hématopoïétiques et progénitrices par rapport aux témoins à 24, 48 et 72 heures, telle que mesurée par le test CCK-8. L’efficacité de l’édition du Trp53 a été estimée à 7,3 % à l’aide de l’analyse TIDE. Et le séquençage de nouvelle génération a révélé des mutations se produisant à différentes positions dans le gène.