Dispositif d’étirement équibiaxique pour microscopie confocale à fluorescence à cellules vivantes à fort grossissement

Nous étudions comment les cellules répondent et s’adaptent aux stimuli mécaniques dans un contexte physiologique et pathologique. Pour cela, nous utilisons le dispositif d’étirement pour appliquer des forces externes, une contrainte dans ce cas, aux cellules.

Nous avons découvert comment les cellules et les tissus cellulaires réagissent à des stimuli mécaniques spécifiques et comment ils répondent mécaniquement à d’autres signaux biologiques.

Notre appareil d’étirement est très polyvalent par rapport à d’autres car il offre la possibilité d’étirer des cellules cultivées sur des gels de polyacrylamide de différentes rigidités ou d’effectuer des expériences de compression.

[Narrateur] Pour commencer, placez les anneaux en PMMA sur une feuille de papier d’établi blanc. Faites soigneusement le tour du bord de la plaque revêtue de PDMS à l’aide d’une lame pour assurer une coupe nette sur toute la circonférence. À l’aide d’une pince à épiler, soulevez la membrane d’un bord, puis épluchez-la doucement avec le pouce pour détacher uniformément la moitié de la membrane de la plaque. Utilisez les doigts pour répartir uniformément l’éthanol à 96 % sur toute la surface supérieure de l’anneau en PMMA. Retirez délicatement la membrane PDMS de la plaque en la soulevant du bord précédemment soulevé. Ensuite, placez-le symétriquement sur l’anneau en PMMA recouvert d’éthanol, en veillant à ne pas froisser tout en évitant l’étirement. Ensuite, prenez un autre anneau en PMMA vide et placez-le sur l’anneau de montage. Utilisez des clips métalliques pour les sceller ensemble, en prenant en sandwich la membrane PDMS entre les deux anneaux. Positionnez la moitié inférieure de l’anneau extensible sur le support de montage. Placez l’anneau PDMS pris en sandwich sur l’anneau extensible et poussez-le fermement vers le bas jusqu’à ce qu’il soit complètement en place, en vous assurant que le joint est correctement positionné. Placez les poids circulaires en laiton sur l’échantillon. Ensuite, placez la moitié supérieure de l’anneau d’étirement métallique sur le dessus, en alignant les trous de vis. Insérez toutes les vis et serrez-les. Coupez doucement le PDMS autour de l’anneau à l’aide d’une lame. Couvrez l’ensemble avec une boîte de Pétri pour protéger la membrane de la poussière. Préparez une dilution de 250 000 billes fluorescentes de 0,2 micromètre dans du PBS en utilisant la dilution en série. Et placez une goutte de 10 à 30 microlitres de la solution de billes au centre du PDMS. Laissez-le sécher à une température ne dépassant pas 40 degrés Celsius pour éviter les problèmes de confusion après durcissement. Montez maintenant l’appareil d’étirement sur le support de platine du microscope et fixez le poteau d’étirement sur le microscope. Appliquez généreusement du lubrifiant sur la zone circulaire du poteau. Montez l’anneau d’étirement préparé sur le poteau d’étirement et vissez le capuchon supérieur pour sceller l’ensemble. Ensuite, connectez l’arrière du boîtier de commande du vide à la source de vide, puis l’avant du boîtier au poteau d’étirement. Pour effectuer l’étalonnage de la déformation, choisissez un champ d’intérêt contenant une densité de billes élevée et des amas de billes reconnaissables par l’utilisateur. Acquérez une image au repos du champ de vision sélectionné et enregistrez la position. Appliquez l’étirement à un faible niveau de vide de moins 20 millibars, provoquant un mouvement dans toutes les directions. Maintenant, refaites la mise au point dans le plan Z et déplacez la platine dans les directions XY pour localiser la même région d’intérêt et acquérir une image à l’état étiré. Ensuite, relâchez la tension et répétez les étapes avec un niveau de vide plus élevé. Stockez les images acquises dans un dossier organisé par échantillon. Nom, l’image de perle de référence acquise sans étirement comme reference_str1 et les images étirées à des niveaux de vide croissants comme stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3, etc. Pour quantifier la déformation, ouvrez MATLAB et chargez le code de la déformation du gel. Après avoir défini les paramètres, définissez le parent, ainsi que les chemins d’accès au dossier d’expérience et exécutez le code. Ensuite, ouvrez-stretched_str1 comme demandé par le code, suivi du reference_str1. Maintenant, calculez la matrice de déformation médiane pour chaque niveau de vide. Après avoir répété ce processus pour au moins trois échantillons, tracez la matrice de déformation médiane en fonction du niveau de vide pour obtenir la courbe d’étalonnage. Pour enrober l’anneau PDMS, stérilisez-le sous lumière ultraviolette pendant 15 minutes. Sous une enceinte de biosécurité, rincez la plaque sous le capot avec du PBS stérile. Après avoir aspiré tout le PBS utilisé pour rincer la plaque. Déposez une goutte de 100 à 200 microlitres de la solution au centre de l’anneau. Tracez le périmètre de la chute avec un marqueur permanent à partir de la face inférieure de la membrane PDMS et incubez-le. Le jour de l’expérience, lavez la protéine d’adhésion avec du PBS. Après avoir essayé les cellules, procédez au comptage cellulaire. Ensemencez un nombre approprié de cellules dans un petit volume d’environ 20 à 50 microlitres avec un milieu cellulaire standard pour favoriser la fixation et incuberez-le dans un incubateur à dioxyde de carbone avec contrôle de l’humidité. Après 20 à 30 minutes, ajoutez doucement 500 microlitres de milieu sur le dessus des cellules et remettez la plaque dans l’incubateur pour permettre une propagation supplémentaire des cellules. Pour un cycle de libération et une imagerie uniques, montez l’anneau d’étirement sur la platine du microscope comme indiqué précédemment. Après avoir localisé une cellule d’intérêt, notez sa position et capturez une image de la cellule pré-étirée. Appliquez le niveau de vide souhaité correspondant à la déformation du substrat requise en fonction de la courbe d’étalonnage pour étirer la cellule. Pour localiser la cellule d’étirement, commencez par réactiver dans le plan Z. Ensuite, déplacez-vous dans les directions XY pour centrer la cellule dans le champ de vision. Enregistrez des images pendant la durée souhaitée. Naviguez jusqu’à la position d’origine de la cellule et activez le mode d’acquisition du microscope pour vous assurer que la capture d’image commence immédiatement après la remise au point. Relâchez l’étirement et refaites rapidement la mise au point manuellement dans le plan Z. Capturez des images de la cellule libérée pendant la durée requise, en ajustant manuellement la mise au point tout au long de l’acquisition. Pour le post-traitement, ouvrez Fidji et chargez les images acquises au repos et pendant la déformation. Utilisez le modèle de plug-in Fidji pour sélectionner une région de la cellule à aligner. L’étalonnage a assuré la reproductibilité et le contrôle de la déformation appliquée, confirmant une relation presque linéaire entre le vide et la déformation jusqu’à 20 %. L’analyse du déplacement radial a démontré l’isotropie et l’homogénéité de la déformation sur la membrane PDMS. L’imagerie par fluorescence des cellules de fibroblastes sous étirement de cellules vivantes a révélé des invaginations membranaires lors de la libération de l’étirement, qui se sont résorbées en trois à cinq minutes. Le réétirement des cellules fixes a permis d’obtenir des images dans un état étiré, empêchant ainsi les artefacts de repliement artificiels. La membrane PDMS avec une grille à motifs a facilité l’imagerie multimodale, permettant la localisation des mêmes cellules en fluorescence et en microscopie électronique à balayage. Les cellules assises sur des gels PAA mous enrobés de fibronectine ne formaient des adhérences focales que lorsqu’elles étaient soumises à des cycles d’étirement cycliques spécifiques par rapport aux cellules non étirées.