Capture des ruptures de sites fragiles communes par γH2A natif. X ChIP

Notre luxe se concentre sur la perte de datation, le rôle de l’instabilité du site fragile commun dans le jive dans la régenèse tumorale. Essayer d’identifier les mobilités virales dans les cellules cancéreuses de l’oncogène gyron qui peuvent être exploitées à des fins thérapeutiques. Sinon, l’imagerie et les technologies de séquençage, telles que la sympathie de cellule unique et l’imagerie de cellules vivantes, fournissent une cartographie à haute résolution de l’instabilité génomique en masse.

La région modélise in vivo y compris le bruit, les modèles de souris génétiquement modifiés et les systèmes de base CRISPR qui nous entourent pour étudier en détail les mécanismes de l’instabilité génomique des oncogènes. L’intérêt à long terme de notre laboratoire est d’identifier les faiblesses spécifiques des cellules cancéreuses qui peuvent être traitées stratégiquement pour les traitements infectés en mettant l’accent sur la minimisation des dommages aux cellules normales. Cela comprend l’exploration des vulnérabilités génétiques et épigénétiques pour découvrir des opportunités thérapeutiques normales.

Pour commencer, traitez les lymphocytes T HEK 293 avec du DMSO, de l’éthyl décaline et de l’hydroxyurée dans trois plaques différentes pendant 24 heures. Après avoir lavé les cellules deux fois avec du PBS, centrifugez-les à 500 G quatre minutes quatre minutes à quatre degrés Celsius. Remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon froid A fraîchement préparé et incubez sur de la glace pendant cinq à 10 minutes.

Observez la progression de la lyse au microscope optique pour confirmer la lyse cellulaire complète. Une fois lysé, centrifugez la suspension cellulaire à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, et remettez en suspension la pastille de noyaux dans 500 microlitres de tampon froid A.Centrifugez, et remettez en suspension les noyaux intacts avec 100 microlitres de tampon de nucléase micrococcique en pipetant cinq à 10 fois. Ajouter immédiatement la quantité prédéterminée de nucléase micrococcique aux échantillons.

Placez les tubes sur un rotateur pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Remettez immédiatement les tubes dans la glace et ajoutez de l’EDTA pour terminer la digestion. Après le vortex, ajoutez 500 microlitres de tampon B et pipetez de haut en bas pour mélanger.

Incuber le tube sur de la glace pendant cinq minutes pour solubiliser les protéines. Pour granuler le matériau insoluble, centrifugez les échantillons à vitesse maximale pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant transparent dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre, étiquetés comme la fraction native de la chromatine.

Pour vérifier la fragmentation de la chromatine, aliquote 10 microlitres de surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Mélangez le surnageant avec 20 microlitres d’eau distillée et 30 microlitres d’alcool isoamylique phénol chloroforme. Après un vortex vigoureux, centrifugez les tubes à 20 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et observez trois couches distinctes : une couche supérieure transparente, une couche intermédiaire blanche et une couche inférieure jaune.

Transférez soigneusement 20 microlitres de la phase aqueuse supérieure, contenant de l’ADN dans un tube frais. Séparez l’ADN purifié dans un gel d’agarose à 1,5 % pendant 30 minutes à 100 volts. Visualisez les schémas de digestion, en vous assurant que la taille des fragments de chromatine est principalement comprise entre 200 et 1 000 paires de bases.

Transférez 20 microlitres de chromatine digérée dans chaque tube, contenant 180 microlitres de tampon d’élution. Étiquetez les tubes comme échantillons d’entrée et stockez-les à moins 20 degrés Celsius. Ajoutez 400 microlitres de chromatine digérée dans un autre tube de 1,5 millilitre pour l’immunoprécipitation de la chromatine, ou puce.

Transférez l’anticorps gamma H2 AX dans un échantillon traité au DMSO, traité à l’éthyl décaline et traité à l’hydroxyurée. Placez les tubes sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant cinq heures, ou de préférence toute la nuit. Pendant ce temps, à l’aide d’embouts à large orifice, aliquote 100 microlitres de protéine magnétique AG de qualité puce perle dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.

Placez le tube sur un support magnétique pendant une minute, puis jetez soigneusement le liquide. Ensuite, mettez les billes en suspension dans un millilitre de PBS contenant 0,5 % de BSA. Faites pivoter le tube à quatre degrés Celsius pendant quatre heures.

Replacez le tube sur le support magnétique pendant une minute et jetez le surnageant. Après le deuxième lavage, remettez en suspension les billes précodées dans 100 microlitres de tampon B.Ajoutez 25 microlitres de suspension de billes magnétiques précodées dans chaque tube d’échantillon de puce. Faites pivoter les tubes à quatre degrés Celsius pendant deux heures, puis placez les tubes à puces sur un support magnétique et attendez que les billes se fixent sur le côté du tube et que la solution devienne claire.

Jetez le surnageant transparent sans déranger les billes magnétiques. Remettez les billes en suspension dans un millilitre de tampon de lavage et faites-les pivoter à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Replacez les tubes sur le support magnétique et attendez que la solution devienne claire avant de jeter le tampon de lavage.

Après le lavage final, centrifugez brièvement les tubes à 400 G pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius pour éliminer le liquide résiduel. Replacez les tubes sur le support magnétique et retirez soigneusement tout liquide restant du fond du tube. Après avoir vérifié l’efficacité de l’extraction de l’anticorps de la puce, à l’aide du western blot, ajoutez 50 microlitres de tampon d’élution à chacun des échantillons de puce restants.

Placez les tubes sur un mélangeur Therma et secouez pendant 15 minutes à température ambiante. Placez les tubes sur un support magnétique pendant une minute et récupérez l’éluit dans de nouveaux tubes. Ajoutez 100 microlitres de tampon d’élution à chaque échantillon d’élution de puce et 180 microlitres de tampon d’élution à chaque échantillon d’entrée.

Ajoutez ensuite 200 microlitres de phénol chloroforme isoamylique à chaque échantillon et agitez vigoureusement les tubes pour mélanger. Après avoir centrifugé les échantillons, transférez soigneusement la couche aqueuse supérieure dans les tubes contenant 19 microlitres de trois molaires d’acétate de sodium et deux microlitres de solution de glycogène. Mélanger en vortex les tubes.

Ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 100 % à chaque échantillon et agitez abondamment. Placez les tubes à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures, ou toute la nuit pour précipiter l’ADN. Ensuite, centrifugez les tubes avant de jeter le surnageant et de remettre le granulé en suspension dans un millilitre d’éthanol à 70 %.

Une fois que l’éthanol résiduel est éliminé par centrifugation, faites sécher les pastilles d’ADN à l’air libre pendant deux à trois minutes avant de les remettre en suspension dans 400 microlitres de tampon TE. Des concentrations plus élevées de nucléases micrococciques ont entraîné une digestion plus étendue de la chromatine, ce qui a entraîné une prédominance de fragments de mononucléosomes. En revanche, à des concentrations plus faibles de nucléases micrococciques, la majorité des fragments de chromatine étaient plus gros, dépassant souvent une base kilométrique.

Les niveaux de Gamma H2 AX étaient significativement élevés dans les cellules stressées par réplication, traitées avec de la décoline éthylique, par rapport aux témoins traités au DMSO, comme le montrent les échantillons d’entrée pour la puce native et la puce réticulée.