Cartographie mécanique des sphéroïdes à l’aide de la spectroscopie de Brillouin

Nous utilisons la spectroscopie de Brillouin pour évaluer de manière non invasive la mécanique cellulaire afin de comprendre le rôle de la mécanobiologie dans la progression de la maladie. Les technologies non invasives, telles que la spectroscopie de Brillouin, nous permettent de caractériser la mécanique en trois dimensions, mais sans perturber l’échantillon. Pour commencer, prétraitez les puits de la plaque micropuits en ajoutant 500 microlitres de solution de rinçage anti-adhérence à chaque puits.

Centrifugez la plaque à 1 300 g pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir éliminé les bulles d’air, retirez la solution anti-adhérence des puits. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS à chaque puits et aspirez-le complètement.

Après avoir répété le lavage PBS, déterminez le nombre de cellules par sphéroïde et le nombre de sphéroïdes par gel selon le plan expérimental. Pelletez les cellules et resuspendez-les dans un millilitre de DMEM complété. Ensuite, ajoutez un millilitre de cette suspension à cellules dans un puits de la plaque micropuits et mélangez bien.

Centrifugez la plaque à 100 g pendant trois minutes à température ambiante. Observez la plaque de micropuits au microscope pour confirmer une distribution uniforme des cellules et qu’elles se sont déposées au fond des puits. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour permettre la formation des sphéroïdes.

Pour récolter les sphéroïdes, retirez doucement et lentement les supports culturels sans déranger les sphéroïdes. Coupez la pointe de pipette recouverte de PBS/FBS pour élargir l’ouverture et ajoutez 500 microlitres de PBS dans chaque puits pour déloger les sphéroïdes. Collectez le PBS contenant les sphéroïdes dans un tube.

Ensuite, transférez 50 microlitres de la suspension sphéroïde dans un puits d’une plaque à 96 puits. Pour faciliter le comptage, dessinez une croix au fond du puits à l’aide d’un marqueur permanent et comptez le nombre de sphéroïdes dans ce volume au microscope. Utilisez l’équation pour calculer le nombre total de sphéroïdes.

Ouvrez le logiciel SpectraLok et attendez que tous les appareils connectés soient détectés. Ensuite, sélectionnez la caméra spectromètre. Installez le cube acrylique sur le porte-échantillons du microscope, le côté transparent étant orienté vers la lentille objective.

Baissez la lentille objective autant que possible et centrez le cube en dessous. Assurez-vous que le chemin optique dans le microscope est réglé de façon à exposer la caméra spectrométrique en tournant le sélecteur de port rotatif pour L.In la fenêtre de la caméra SpectraLok, en réglant le temps d’exposition du capteur à 500 millisecondes et le gain logiciel à 100. Appuyez sur Capture, et déplacez lentement la lentille de l’objectif vers le haut.

Continuez à relever le cristallin jusqu’à ce que les pics de Brillouin deviennent visibles et que leur intensité se stabilise, indiquant que le point focal est positionné à l’intérieur du cube acrylique. Maintenant, ouvrez la fenêtre de contrôle Pump Killer, ou PK. Zoomez sur l’un des ordres Brillouin les plus brillants et ajustez la position de l’actionneur de pression par incréments de 100 micromètres en cliquant sur déplacer rel pour minimiser l’intensité maximale de Rayleigh.

Si le signal de Rayleigh augmente, cliquez sur Inverser pour changer la direction d’ajustement. Lorsque l’intensité maximale de Rayleigh diminue, ajustez finement la pression de l’étalon par petits incréments de 10 micromètres. Dans la fenêtre de la caméra, zoomez sur l’un des ordres Brillouin.

Appuyez sur S pour visualiser les bandes sur lesquelles la LUT est appliquée à l’image de la caméra. Ouvrez la fenêtre des Paramètres et appuyez sur Calibration rapide pour recalculer automatiquement le décalage horizontal optimal des bandes. Après vérification de l’alignement des bandes, ajustez les axes de la lentille du collimateur pour maximiser l’efficacité de couplage de la lumière entre le Pump Killer et le spectromètre.

Ensuite, ouvre la fenêtre Spectrum et clique sur Déplier pour récupérer le spectre. Dans un cube acrylique homogène, visez une suppression complète du signal de Rayleigh et ajustez jusqu’à ce que le signal de Brillouin soit clairement visible. Pour sauvegarder les paramètres optimisés, cliquez sur Actualiser tout, puis Sauvegarder tout dans la fenêtre de contrôle PK.

Enfin, dans la fenêtre principale, cliquez sur Enregistrer dans la section E/S du fichier pour enregistrer la configuration. Après avoir ouvert le logiciel de balayage, installez la boîte de Petri à fond de verre contenant l’échantillon sphéroïde hydrogel à la place du cube acrylique. Retirez le couvercle de la boîte de Petri, ajoutez suffisamment de substrat pour immerger le gel, puis placez une couverture pour éviter les mouvements du gel.

Localiser le sphéroïde en bloquant d’abord le faisceau laser. Changez le chemin optique du microscope vers l’oculaire et allumez l’éclairage à lumière blanche. À l’aide du joystick, contrôlez manuellement l’étape d’échantillonnage pour localiser et focaliser le sphéroïde.

Acquérez une image en champ clair du sphéroïde et ajustez la luminosité de l’éclairage en faisant pivoter la molette de contrôle. Changez le chemin optique sur R pour exposer la caméra du microscope et réglez le temps d’exposition selon les besoins. Ensuite, réglez le port du microscope sur L et capturez le fond avec le laser toujours bloqué.

Débloquez le laser et, selon le rapport signal/bruit souhaité, sélectionnez un temps d’exposition compris entre 200 et 500 millisecondes. Dans le spectre non déroulé, sélectionnez la gamme Brillouin Peak Fitting. Ajustez la valeur seuil à environ la moitié de l’intensité de pic de Brillouin, et excluez tous les pics de Brillouin dont l’amplitude est inférieure au seuil.

Appliquez la correction de la longueur d’onde au laser selon toutes les paires de pics de Brillouin identifiées. Enfin, choisissez la géométrie du balayage raster en ajustant la largeur du balayage et la taille du pas, puis lancez le balayage pour enregistrer les mesures. Des images représentatives d’un sphéroïde de cellules souches mésenchymales intégrées dans l’hydrogel ont montré des cartes distinctes de décalage et de largeur de raie de Brillouin, ainsi que des images correspondantes de fluorescence des champs lumineux, des noyaux et des filaments d’actine.

La carte de décalage de fréquence Brillouin à basse résolution a été segmentée en régions gel et sphéroïde selon le contour tracé manuellement à partir de l’image du champ clair. Les pixels ambigus résultant du sous-échantillonnage ont été exclus de l’analyse tandis que des masques binaires clairs pour les régions du gel et des sphéroïdes ont été créés pour extraire les valeurs BFS. La comparaison des cartes BFS haute et basse résolution a montré que l’échantillonnage de carottes fournissait des valeurs moyennes de BFS comparables aux scans à haute résolution, indiquant une mesure cohérente de la mécanique de la masse sphéroïde.

Notre protocole offrira une plateforme permettant aux chercheurs d’étudier de nombreuses maladies liées à la mécanobiologie. Il sera intéressant de voir si les changements dans le décalage de Brillouin, liés aux propriétés mécaniques cellulaires, sont des marqueurs efficaces pour les étapes de progression de la maladie. Nous évaluerons comment les traitements médicamenteux influencent la mécanique sphéroïde sur des échelles temporelles qui imitent la progression de la maladie.