Identification de sites d’intégration de lentivirus fonctionnellement pertinents dans une banque de cellules de mutagenèse insertionnelle

Nous menons des recherches en génomique fonctionnelle en mettant l’accent sur l’identification et la caractérisation des éléments fonctionnels du génome humain. Notre principal intérêt est d’explorer la partie du génome qui n’a pas encore été bien attribuée afin de mieux comprendre leurs rôles potentiels et comment elles pourraient contribuer à la biologie humaine et à la maladie. Les outils actuels de génétique inverse ont certaines limites, telles que des effets non spécifiques et un coût élevé dans la création de bibliothèques complexes de SSI ou de SGI.

Un autre défi est que cette méthode peut ne cibler que les éléments génomiques alloués, laissant une grande partie du génome sous-explorée. Le protocole développé ici offre une nouvelle approche pour identifier des éléments génomiques jusqu’alors inconnus, y compris de nouveaux exons fonctionnels dans les yeux codants pour les protéines et les yeux codants longs. Pour commencer, utilisez de l’ADN génomique isolé à partir d’une bibliothèque de cellules de mutagenèse insertionnelle à base de lentivirus comme modèle pour une PCR linéaire dans une réaction de 50 microlitres. Alors.

ajoutez les autres réactifs requis indiqués ici dans le tube PCR. Effectuez 50 cycles de PCR linéaire dans un thermocycleur standard dans les conditions de PCR données. Transférez les produits PCR dans un nouveau tube à centrifuger propre de 1,5 millilitre.

Mélangez soigneusement les produits PCR avec 10 microlitres de billes magnétiques de biotine-streptavidine et incubez le mélange pendant deux heures à température ambiante, en agitant à 400 tr/min dans un bain métallique. Ensuite, utilisez un support magnétique pour recueillir les billes et retirez soigneusement le surnageant. Lavez les perles avec 300 microlitres de liant ou de tampon de lavage six fois, en jetant le surnageant après chaque lavage.

Pour la synthèse du deuxième brin, remettre les billes en suspension dans un volume de réaction de 24 microlitres contenant un tampon de fragments de Klenow, un mélange DNTP et une amorce P5N6 dans un tube PCR. Pré-incubez le mélange à 15 degrés Celsius pendant 20 minutes dans un thermocycleur PCR, puis ajoutez deux unités de fragment de Klenow au mélange réactionnel. Incuber les mélanges dans un thermocycleur PCR dans les conditions données.

Ensuite, transférez les produits PCR dans un nouveau tube à centrifuger propre de 1,5 millilitre. Utilisez un support magnétique pour capturer les billes et jeter le surnageant. Après cela, lavez doucement les billes avec 300 microlitres d’eau distillée sans DNase et RNase à quatre degrés Celsius.

Récupérez les perles et jetez le surnageant. Remettez les billes en suspension dans un volume de réaction PCR de 25 microlitres contenant un tampon Taq, une ADN polymérase Taq, une amorce P5, un mélange DNTP et une amorce 3-LTR_Nest dans un tube PCR. Effectuez la PCR dans un thermocycleur avec les paramètres indiqués ici.

Utilisez cinq microlitres de produits PCR comme modèle pour la prochaine série de réactions PCR avec l’amorce Illumina P5 et l’amorce Illumina P73-LTR. Effectuez la PCR dans un thermocycleur dans les conditions données. Ensuite, transférez les produits PCR dans un tube à centrifuger propre de 1,5 millilitre.

Après avoir équilibré les perles de deux à huit degrés Celsius à température ambiante pendant 30 minutes, mélangez soigneusement les perles en les inversant ou en les vortexant. Pipetez 1,2 fois le volume des billes dans un tube à centrifuger propre de 1,5 millilitre. Ajoutez les produits PCR dans les billes et mélangez soigneusement en pipetant 10 fois de haut en bas.

Incuber les billes pour permettre à l’ADN de s’y lier. Ensuite, placez les échantillons sur un support magnétique et retirez le surnageant une fois que la solution est claire. Maintenant, lavez les billes avec 200 microlitres d’éthanol à 80 %.

Incuber à température ambiante pendant 30 secondes et retirer le surnageant. Faites sécher les perles à l’air libre à température ambiante avec le couvercle ouvert pendant environ cinq minutes. Maintenant, retirez le tube du support magnétique.

Ajoutez 22 microlitres d’eau distillée sans DNase et RNase. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas 10 fois et laissez reposer à température ambiante pendant deux minutes. Replacez le tube sur le support magnétique jusqu’à ce que la solution soit claire.

Ensuite, transférez 21 microlitres de surnageant dans un tube à centrifuger propre de 1,5 millilitre. Pour mesurer la concentration avec le fluorimètre, préparez la solution de travail en mélangeant le réactif et le tampon dans un rapport de un à 200. Mélangez 10 microlitres de l’étalon un et 10 microlitres de l’étalon deux, chacun avec 190 microlitres de solution de travail, pour préparer les étalons de dosage.

Agitez doucement les mélanges pendant deux à trois secondes. Ensuite, préparez l’échantillon de test en mélangeant un microlitre de produits PCR purifiés avec 199 microlitres de solution de travail. Agitez doucement le mélange pendant deux à trois secondes.

Incuber les étalons de dosage et les échantillons de dosage pendant deux minutes à température ambiante, en les gardant à l’abri de la lumière, puis allumez le fluorimètre. Sélectionnez le programme de test d’ADN double brin à haute sensibilité dans le menu principal. Pour l’étalonnage, insérez l’étalon dans la machine et appuyez sur le bouton de lecture de l’étalon pour mesurer le premier étalon.

Ensuite, insérez l’étalon deux et appuyez sur le bouton de lecture de l’étalon pour mesurer le deuxième étalon. Pour la mesure d’échantillons, appuyez sur le bouton Exécuter des échantillons pour accéder à la page de mesure d’échantillons. Insérez chaque tube contenant l’échantillon de test et appuyez sur le bouton de lecture du tube pour obtenir la concentration.

Dans l’échantillon de faible qualité, un pic dominant autour de 83 paires de bases indique une contamination par le dimère de l’adaptateur. En revanche, la bibliothèque NGS de haute qualité affiche des pics principaux compris entre 150 et 1 500 paires de bases, ce qui reflète le profil d’une bibliothèque réussie.