Name: Méthode efficace d’imagerie des poumons murins qui préserve la dynamique spatiale des spores fongiques dans les voies respiratoires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie pulmonaire chez la souris préservant la position naturelle des spores fongiques dans les voies aériennes. Cette approche permet une analyse précise par microscopie à fluorescence des interactions hôte-pathogène.

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Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de Rutgers Biomedical Health Sciences.
1. Marquez les spores avec une fluorescence intracellulaire
<ol>
	<li>Colorez 1 x 106 spores dans de l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE), du Cell Tracker Orange ou du Cell Tracker Red (ou du colorant intracellulaire de votre choix) à 5 μM pendant 30 min à 30 °C, puis lavez avec du PBS et essorez les spores à 12 000 x g. Répétez ce lavage une fois.</li>
	<li>Préparez l’inoculum de spores à la concentration appropriée de sorte que 25 μL contiennent la dose de spores appropriée pour une souris.</li>
</ol>
2. Inoculation de spores à la souris par inhalation par aspiration à l’aide d’une anesthésie à l’isoflurane
ATTENTION : L’isoflurane est un agent anesthésique volatil et doit être utilisé dans une enceinte de biosécurité canalisée ou une hotte.
<ol>
	<li>Pour préparer le pot d’exposition à l’isoflurane, placez une serviette pliée dans un pot Nalgene à vis de 1 L et placez un cercle en plastique sur la serviette comme plate-forme pour les souris. Ajoutez 2 ml d’isoflurane dans la serviette, fermez le pot et attendez 1 à 2 minutes que le gaz s’équilibre dans le récipient.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig01.jpg"> 
Figure 1 : Appareil pour la méthode d’inoculation des spores à l’aide d’isoflurane à goutte ouverte. Une serviette pliée est placée au fond d’un bocal à vis de 1 L, puis un treillis circulaire en plastique est inséré pour servir de plate-forme aux souris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="2">
	<li>Avant d’exposer la souris à l’anesthésie, préparez une pipette avec 25 μL d’inoculum. Placez la souris dans le récipient d’isoflurane et inclinez le récipient pour surveiller la perte du réflexe de redressement, c’est-à-dire que la souris a perdu conscience et est à l’envers. Cela prend généralement environ 10 s.</li>
	<li>Surveillez la fréquence respiratoire (RR) jusqu’à ce qu’elle ralentisse à un niveau constant de 50 à 80 respirations par minute (bpm), soit environ 50 % de la RR au repos. Cela prend généralement 10 secondes supplémentaires. À ce moment, retirez la souris du bocal d’isoflurane. REMARQUE : Il s’agit d’une forte concentration d’isoflurane, qui produira une induction rapide de l’anesthésie, et la souris doit être surveillée de très près. Un surdosage mortel d’isoflurane présente un risque, car la concentration d’isoflurane peut être variable et la courbe dose-réponse à l’isoflurane est très abrupte. Si la fréquence respiratoire descend en dessous de 50 bpm et/ou est irrégulière, retirez la souris de l’isoflurane, laissez-la récupérer pendant 3 à 5 minutes et réessayez (un maximum de deux tentatives répétées).</li>
	<li>Confirmez la profondeur de l’anesthésique par l’absence de réponse au pincement de l’orteil. Ensuite, positionnez la souris en position couchée d’une main et permettez-lui de prendre 3 à 5 respirations haletantes régulières avec un rythme croissant (à partir de 50-60 bpm) et une vigueur. Lorsque cela commence, placez l’extrémité de la pipette à l’arrière de l’oropharynx de la souris et libérez l’inoculum lors d’une inspiration. REMARQUE : Ces halètements par la bouche secouent la tête vers le bas en raison du recrutement de muscles accessoires pour la respiration. Lorsque la pipette est insérée pendant ces halètements, la bouche doit s’ouvrir à chaque halètement. Si la bouche ne s’ouvre pas, la souris n’est pas suffisamment anesthésiée et n’inhalera probablement pas le contenu de l’oropharynx. La pipette doit enfoncer la langue, la pousser vers le bas et l’avant de la bouche pour éviter l’infusion de l’inoculum. Lorsque la pipette est dans la bouche et que la souris est correctement anesthésiée, la souris ouvre la bouche à chaque halètement.</li>
	<li>Avec la main et le pouce tenant la souris, palpez les crépitements sur les faces postérieure et antérieure du thorax de la souris pour confirmer l’inhalation de l’inoculum.</li>
</ol>
3. Euthanasie des souris
<ol>
	<li>Injectez à la souris par voie intrapéritonéale un cocktail de 200 mg/kg de kétamine et de 24 mg/kg de xylazine 10 minutes avant le moment du sacrifice.</li>
	<li>Attendre 10 minutes après l’injection jusqu’à ce que la souris entre dans un plan chirurgical d’anesthésie, confirmé par l’absence de réponse au pincement de l’orteil.</li>
</ol>
4. Perfusion des poumons avec PBS et formol
<ol>
	<li>Vaporisez la souris anesthésiée avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux pour couper la peau de la souris et séparez la peau pour exposer le péritoine de tous les côtés. Tirez la peau de la moitié supérieure de la souris sur sa tête, en retirant les bras de la peau.</li>
	<li>Coupez la membrane péritonéale au niveau du sternum et le long de la face inférieure de la cage thoracique, exposant le péritoine. Déplacer le foie vers le bas, révélant le diaphragme. Utilisez des ciseaux pour percer soigneusement le diaphragme loin du parenchyme pulmonaire afin d’éviter de percer un trou dans les poumons eux-mêmes. REMARQUE : Perforer par inadvertance les poumons rendra impossible le gonflage ultérieur de l’air.</li>
	<li>Après la perforation du diaphragme, l’air pénètre dans le thorax, ce qui fait s’effondrer les poumons. Coupez la cage thoracique sur le côté gauche pour révéler le cœur. Injecter 5 à 10 ml de PBS dans le ventricule droit avec une aiguille de 30 G à raison de 1 ml toutes les 5 s (pour éviter d’endommager les vaisseaux), en blanchissant rapidement les poumons. ATTENTION : Le formol est une substance volatile dangereuse qui doit être manipulée dans une enceinte de biosécurité canalisée ou une hotte.</li>
	<li>Lorsque vous avez terminé, retirez l’aiguille et utilisez une nouvelle aiguille pour injecter 5 ml de formol à tampon neutre (FBN) à 10 % dans le ventricule droit au même rythme.</li>
</ol>
5. Gonflement à l’air du poumon perfusé
<ol>
	<li>Retirez la moitié antérieure de la cage thoracique. Pour exposer la trachée, coupez les côtes supérieures et les clavicules à droite et à gauche du cou. Prenez soin d’éviter de couper près de la ligne médiane où se trouvera la trachée. À l’aide d’une pince, agrippez les côtes supérieures et les clavicules restantes sur la ligne médiane du cou et tirez vers le haut jusqu’à ce que la trachée soit exposée.</li>
	<li>Préparez un fil de suture de 10 cm de long, passez-le sous la trachée et faites un nœud lâche à l’extrémité inférieure de la trachée exposée. Préparez une seringue d’air de 1 mL avec un cathéter de 18 G. À l’aide d’une aiguille de 18 G, faites un trou dans la trachée à l’extrémité supérieure de la région exposée.</li>
	<li>Placez le cathéter dans ce trou, en veillant à ce qu’il soit relativement serré pour empêcher l’air de s’échapper. Injectez lentement 1 ml d’air dans les poumons pendant 10 s, en surveillant le gonflement pulmonaire de tous les lobes. Le gonflage complet fait que les poumons s’enroulent légèrement autour du cœur et remplissent le volume qu’ils occupent dans le diaphragme non perforé.</li>
	<li>Tirez le nœud autour de la trachée et retirez le cathéter. Tenez la trachée et utilisez des ciseaux émoussés pour retirer les poumons de la souris, en faisant attention de ne pas percer le poumon.</li>
</ol>
6. Fixation par immersion et déshydratation
<ol>
	<li>Placez les poumons sur le bord supérieur d’un tube conique de 50 ml rempli de 20 ml de FBN à 10 %. Gardez les fils de suture à l’extérieur de la conique, vissez le capuchon et inversez la conique de sorte que les poumons soient suspendus à l’envers dans 20 ml de FBN. Placez-le à 4 °C pendant 24-48 h.</li>
	<li>Rincer les poumons au PBS, puis les placer dans une solution à 30 % de saccharose-PBS (p/v) pendant 72 à 96 h à 4 °C pour déshydrater les poumons en vue de la cryoconservation. Retirez les poumons du saccharose, placez-les dans un cryomoule avec un milieu à température de coupe optimale (OCT) et congelez l’échantillon à -80 °C.</li>
</ol>
7. Cryosectionnement
<ol>
	<li>Équilibrez les échantillons dans les cryoblocs OCT à la température de -20 °C du cryostat pendant 1 h avant la section. Sectionnez les blocs à des épaisseurs de 20 à 100 μm. REMARQUE : Le gonflage à l’air peut entraîner une fragilité accrue de l’échantillon, et une coupe à une épaisseur accrue peut prévenir la rupture des tissus pendant la section.</li>
	<li>Prélever des sections sur des lames de verre et laisser sécher pendant 30 min à 1 h pour assurer l’adhérence du tissu à la lame. REMARQUE : Les diapositives peuvent être maintenues à -80 °C à ce stade.</li>
</ol>
8. Préparation et blocage des lames
<ol>
	<li>Placez les lames dans un bain PBS (dans un plat ou un bocal Coplin) pendant 30 min à température ambiante (RT) pour éliminer l’OCT des lames. REMARQUE : Les sections plus épaisses (40-100 μm) peuvent ne pas adhérer aux lames de verre ainsi qu’aux sections plus minces, il est donc préférable de les garder plates et verticales dans un plat plutôt que de les placer sur le côté dans un bocal Coplin.</li>
	<li>Séchez les lames une fois que l’OCT s’est dissous loin du tissu. Utilisez une lingette pour sécher les gouttelettes en excès du périmètre de la lame autour de l’échantillon de tissu. </li>
	<li>À l’aide d’un stylo Pap hydrophobe, tracez un périmètre autour de l’échantillon et laissez-le sécher pendant 5 minutes.</li>
	<li>Préparez un tampon de blocage de solution de blocage sans animaux avec 0,3 % de Tween-20 et un bloc de 1:100 Fc dans 300 mL par lame. REMARQUE : Pour les cibles intracellulaires, 1 % de Tween-20 peut être utilisé. Un volume de 300 μL est généralement suffisant, mais le volume nécessaire pour couvrir entièrement le tissu dépend de la taille du périmètre du marqueur hydrophobe. Le tissu ne doit pas sécher à partir de ce moment.</li>
	<li>Laissez la solution de blocage sur les lames pendant 1 h à RT.</li>
</ol>
9. Immunomarquage
<ol>
	<li>Lavez la lame en pipetant le liquide et en ajoutant 300 à 500 μL de PBS. Répétez le lavage une fois.</li>
	<li>Préparez l’anticorps primaire conjugué AlexaFluor-647 anti-souris EpCAM (clone G8.8) (marqueur épithélial des voies respiratoires) dans une solution bloquante exempte d’animaux avec 0,33 % de Tween-20 (ou 1 % pour les cibles intracellulaires). Ajouter 300 μL par lame de cette solution et colorer toute la nuit à 4 °C. REMARQUE : Les anticorps doivent être testés empiriquement pour la concentration, le temps et la température de la coloration. Les lames minces (8-20 μm) sont colorées pendant 30 min à 37 °C et les sections plus épaisses (20-100 μm) à 4 °C pendant la nuit en utilisant des dilutions 1:100 pour la plupart des anticorps. Si vous utilisez des anticorps non conjugués, laver 2 fois (comme ci-dessus) et appliquer un anticorps fluorescent secondaire pendant une durée et une température déterminées empiriquement. Généralement, la coloration secondaire des anticorps est effectuée à RT pendant 1 h à une dilution de 1:1000.</li>
	<li>Retirer la solution d’anticorps de l’échantillon et laver la lame avec 300 mL de PBS pendant 5 min. Répétez ce lavage une fois. Séchez les lames en enlevant tout excès de liquide de l’échantillon et du verre environnant.</li>
	<li>Ajoutez une goutte de support de montage RT soft set (par exemple, SlowFade Glass) sur chaque morceau de tissu. Prenez soin d’éviter les bulles en laissant le flacon se déposer à l’envers et en déposant lentement chaque goutte sur les mouchoirs. Placez une lamelle de taille appropriée pour s’étendre au-delà du périmètre de l’échantillon et du marqueur hydrophobe.</li>
</ol>
10. Imagerie par microscopie fluorescente
<ol>
	<li>Utilisez un microscope fluorescent multicanaux pour balayer des coupes pulmonaires entières de manière impartiale à l’aide d’un objectif ayant une résolution suffisante pour résoudre les spores individuelles et les cellules hôtes (par exemple, Zeiss Axioscan 7 avec un objectif d’huile 20x avec NA = 0,8 ou similaire). REMARQUE : Assurez-vous que la puissance laser et le gain de tension PMT sont réglés pour maximiser les rapports signal/bruit de la cible sur l’arrière-plan déterminés avec une commande de fluorescence moins un (FMO).</li>
	<li>Recueillir suffisamment de tuiles d’image pour capturer l’ensemble du lobe pulmonaire (p. ex., ~200 tuiles de 400 μm x 400 μm). Utilisez le logiciel de microscope (par exemple, Zeiss ZEN 3.7 ou similaire) pour exporter l’image des carreaux fusionnés pour le traitement en aval.</li>
</ol>
11. Analyse spatiale via QuPath
<ol>
	<li>Dans QuPath, un logiciel open source gratuit14, créez un fichier de projet et ajoutez-y les images fluorescentes.</li>
	<li>Classez les pixels EpCAM+ en tant qu’épithélium en cliquant sur l’option de menu supérieure Classifier, puis sur Classification des pixels &gt; Créer un seuil. Sélectionnez la résolution, le canal, le sigma de lissage et la valeur de seuil qui identifient le mieux la région cible. Enregistrez le classifieur sous un nom unique, puis sélectionnez Créer des objets.</li>
	<li>Dans la nouvelle fenêtre Créer des objets , sélectionnez Nouveau type d’objet en tant qu’annotation. Pour l’épithélium pulmonaire, réglez la taille minimale de l’objet et la taille minimale du trou à 100 mm2. Il n’est pas nécessaire de sélectionner Diviser les objets ici. Après avoir sélectionné OK, les annotations seront créées et elles peuvent être modifiées à l’œil nu à l’aide de l’outil Pinceau dans la zone supérieure gauche.</li>
	<li>Pour classer les spores, répétez les étapes de 11.3 à 11.4 en utilisant le canal dans lequel les spores ont été capturées et faites en sorte que le nouveau type d’objet soit Détection plutôt qu’Annotation. Définissez la taille minimale de l’objet et la taille minimale du trou sur 0 mm2, puis sélectionnez Diviser les objets.</li>
	<li>Pour effectuer une analyse spatiale des spores, sélectionnez l’option de menu supérieure Analyser &gt; Analyse spatiale &gt; Calculer la distance signée aux annotations 2D. Les distances jusqu’à l’épithélium EpCAM+ seront calculées pour chaque spore détectée. Exportez-les via l’option de menu supérieure Mesure &gt; Exporter les mesures.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Préservation de la localisation des spores fongiques dans les poumons pour l’analyse par microscopie fluorescente

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<li>Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isoflurane+anesthesia+using+the+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Mouse isoflurane anesthesia using the drop method.</a> Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>18 G, 1 1/2 aiguille (305185)</td><td>Fisher</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>1 L&nbsp ; Pot à vis&nbsp ; (Nalgene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td></td></tr><tr><td>Seringues non stériles en vrac Air-Tite 10 mL Luer Lock</td><td>Fisher</td><td>14-817-175</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed injectable (solution stérile de xylazine)</td><td>Akorn</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueur et diluant sans animaux, R.T.U.</td><td>Vector</td><td>SP-5035-100</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard Cathéter IV à écran ailé avec matériau de cathéter BD Vialon 18 g x 1,88 po</td><td>BD</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Purifié Rat Anti-souris CD16/CD32 (souris BD Fc Block&trade ;)</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMRA Colorant</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC0873640</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Labviva</td><td>75003</td><td></td></tr><tr><td>Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&Delta ; &nbsp ;</td><td>BEI Resources</td><td>NR-166</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 microns Filtres</td><td>VWR</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM AlexaFluor647 Anticorps monoclonal</td><td>Biolegend</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Aiguilles HYpodermic 30 G x 1/2"</td><td>Labviva</td><td>EN3012</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Seringues stériles à usage unique (1mL, Leur Slip)</td><td>Fisher</td><td>14-955-462</td><td></td></tr><tr><td>Glucose monohydraté</td><td>Azer Scientific&nbsp ;</td><td>ES17530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Graisse sous vide</td><td>poussé VWR</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Solution 20 mM (5 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine</td><td>Dechra</td><td>1000001250</td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES Essuie-glaces Delicate Task (4.4'' x 8.4")</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Ciseaux pour bébé</td><td>FST</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince Micro-Adson</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Formol tamponné neutre (10 %) (Azer Scientific)</td><td>Fisher</td><td>22-026-350</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask flacons de culture tissulaire, T75, capuchons filtrants</td><td>VWR</td><td>15708-134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way moules d’encastrement</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.5.1 Logiciel</td><td>Open-source</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>Fil de suture en soie taille 3/0</td><td>FST</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>DiapositivesMicro Slides Superfrost Plus&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Verre SlowFade Soft-set Antifade Mountant (2 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ThermoFischer</td><td>J20605. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Vector Laboratories ImmEDGE Stylo barrière hydrophobe Ensemble de 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glasses, Rectangulaire (24 mm x 40 mm #1.5)</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>Grillage en plastique blanc</td><td>MAPORCH</td><td>789862904922</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher</td><td>BP9727-500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioScan 7&nbsp ;</td><td></td><td>Microscope fluorescent multicanaux</td> <td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html Carl Zeiss Microscopy GmbH</td></tr><tr><td>Logiciel ZEN 3.7 Logiciel</td> de <td>microscopie</td> <td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html</td> Carl <td>Zeiss Microscopy GmbH</td></tr></tbody></table>

méthode efficace d’imagerie des poumons murins qui préserve la dynamique spatiale des spores fongiques dans les voies respiratoires

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Cette méthode produit finalement des images immunofluorescentes des poumons de souris en utilisant le gonflage physiologique de l’air pour laisser les voies respiratoires intactes. Il est important de noter que plusieurs points de contrôle en cours de route confirmeront que les composants du protocole ont été exécutés avec succès. Lors de l’inoculation, il est important de confirmer que l’inoculum a été aspiré en palpant des « crépitements » sur la paroi thoracique postérieure de la souris qui indiquent que le liquide a pénétré dans les voies respiratoires. S’il n’y a pas de sensation de crépitements, il est possible que la souris ait avalé l’inoculum. La perfusion des poumons de souris avec le PBS devrait entraîner des marbrures blanches des poumons suivies d’un blanchiment complet de l’ensemble du poumon (figure 2A). S’il y a un blanchiment incomplet, la perfusion de formol qui s’ensuit n’atteindra pas toutes les zones du parenchyme pulmonaire (Figure 2B). Lors du gonflage du poumon avec de l’air, les poumons doivent se distendre lentement jusqu’à ce qu’ils atteignent une taille physiologique. Après avoir attaché la suture trachéale pour sécuriser l’air à l’intérieur des poumons, les poumons ne doivent pas se contracter en taille. Si c’est le cas, le poumon a probablement été perforé pendant la procédure.
Ici, nous montrons des images représentatives de coupes avec des spores de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ marquées (vert) et un épithélium bronchiolaire cylindrique EpCAM+ (magenta) dans des poumons gonflés à l’air et des poumons gonflés au formol (figures 3A, B respectivement). Ces spores s’accumulent principalement dans les bronchioles distales et dans les espaces alvéolaires immédiatement adjacents à ces bronchioles distales, probablement dans les canaux alvéolaires. Les poumons gonflés par un fixateur contiennent des spores qui apparaissent plus fréquemment dans les bronchioles et se regroupent plus près des bronchioles (figure 3A), plutôt que le fixateur liquide où les spores semblent légèrement plus dispersées à partir de l’épithélium bronchiolaire (figure 3B). Grâce à l’analyse spatiale QuPath, nous mesurons la distance des spores individuelles par rapport à l’épithélium bronchiolaire EpCAM+ le plus proche afin d’indiquer le niveau de dispersion des spores loin de la bronchiole et dans des espaces alvéolaires plus distaux. Nous montrons que l’inflation liquide disperse les spores plus loin des bronchioles par rapport à l’inflation physiologique de l’air (Figure 4A,B). La perfusion vasculaire par gonflage aérien préserve le positionnement naturel de ces spores dans les bronchioles distales et empêche la dispersion artificielle de ces spores dans des espaces alvéolaires plus distaux par instillation fixatrice intratrachéale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig02.jpg"> 
Figure 2 : Indication de succès de la perfusion pulmonaire. (A) Les poumons perfusés avec succès seront complètement blancs. (B) Les poumons incomplètement perfusés apparaîtront roses ou tachetés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig03.jpg"> 
Figure 3 : Images représentatives de la distribution des spores dans les poumons gonflés au formol gonflés à l’air par rapport aux poumons gonflés au formol. Les spores fluorescentes intracellulaires (en vert) sont distribuées plus près de l’épithélium bronchiolaire EpCAM+ (magenta) dans les poumons gonflés à l’air (A) que dans les poumons gonflés au formol (B). Des images ont été obtenues à partir de coupes d’une profondeur de 1,2 mm à partir de la surface postérieure des lobes gauches de souris de chaque groupe de traitement sur un microscope fluorescent multicanaux à un grossissement de 20x, et les carreaux ont été assemblés à l’aide d’un logiciel de microscopie. Barre d’échelle = 800 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig04.jpg"> 
Figure 4 : Comparaison de la distance entre les spores (mm) et l’épithélium bronchiolaire entre les poumons gonflés à l’air et les poumons traités par des spores gonflées au formol. Les poumons de 3 souris par groupe de traitement ont été prélevés, traités et imagés pendant 1,5 h après l’inoculation avec 1 x 106Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidies. Quatre sections par souris ont été échantillonnées à 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm et 2,0 mm de la surface postérieure du lobe gauche, colorées et imagées au microscope fluorescent multicanaux. Toutes les spores de chaque groupe ont été détectées et analysées spatialement dans QuPath pour déterminer la distance (A) jusqu’à l’épithélium bronchiolaire cylindrique EpCAM+ le plus proche, et (B) la médiane et les intervalles de confiance à 95 % sont affichés en micromètres. Spores de gonflage dans l’air, n = 11 673. Spores d’inflation liquide, n = 9 837. Le test t de Mann-Whitney a été réalisé en raison d’un manque de normalité, et p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Méthode efficace d’imagerie des poumons murins qui préserve la dynamique spatiale des spores fongiques dans les voies respiratoires

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l'observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu'ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

Cette vidéo décrit une méthode de préparation des poumons pour l’imagerie en direct ex vivo afin d’étudier les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales, en utilisant l’agarose pour l’inflation. Dans le protocole d’échantillonnage, la procédure de gonflage de l’agarose est décrite avant l’observation des interactions cellulaires en direct.

Gonflage de l’agarose pulmonaire entière : une méthode de préparation des poumons pour l’imagerie en direct ex vivo

Nous décrivons une méthode relativement simple pour ex vivo l'imagerie en direct de la tumeur interactions cellule-stroma dans les métastases du poumon, en utilisant journalistes fluorescentes chez la souris. Utilisation à disque rotatif microscopie confocale, cette technique permet de visualiser les cellules vivantes pendant au moins 4 heures et peut être adapté à l'étude d'autres maladies pulmonaires inflammatoires.

Ex vivo l&#39;imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement

Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer une imagerie à long terme, à haute résolution, sur cellule unique, du poumon intact en temps réel à l’aide d’une fenêtre d’imagerie stabilisée sous vide.

À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Nous décrivons un multimodal non invasive d’imagerie approche basée sur la Micro-CT et fluorescence moléculaire tomographie pour une évaluation longitudinale du modèle souris poumon fibrose induite par instillation intratrachéale double de la bléomycine.

Un Multimodal à l’approche d’imagerie basée sur Micro-CT et Fluorescence moléculaire de positons pour une évaluation longitudinale de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine chez la souris

Nous décrivons l’imagerie optique des souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) utilisant journaliste enzyme fluorescence (REF). Ce protocole facilite la détection sensible et spécifique de M. tuberculosis dans des modèles animaux précliniques pour recherche de vaccin, la thérapeutique et la pathogenèse.

Imagerie de Mycobacterium tuberculosis chez la souris avec la journaliste Enzyme Fluorescence

Nous décrivons ici un protocole visant à déterminer les poids de fongiques pulmonaires chez les souris présentant l’aspergillose invasive par quantification de mis à jour le méthanamine coloration à l’argent de Gomori dans les coupes histologiques. Utilisation de cette méthode aboutit à des résultats comparables avec moins animaux par rapport à l’évaluation du fardeau fongique par PCR quantitative de l’ADN fongique de poumon.

Histologique Quantification pour déterminer la charge fongiques dans les poumons dans l’aspergillose expérimentale

Dans cette étude, nous présentons un protocole pour effectuer deux photons intravitale d’imagerie et de la cellule analyse des interactions dans la muqueuse trachéale murine après infection par le virus de la grippe. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui étudient la dynamique de cellules immunitaires lors d’infections respiratoires.

Imagerie cellulaire Interaction dans la muqueuse trachéale au cours de l’infection par le Virus grippal à l’aide de la microscopie intravitale biphotonique

Dans cette publication, nous décrivons des protocoles pour évaluer le dégagement mucociliary de voie aérienne (MCC) chez les souris in vivo utilisant la formation image de radionucléide de double modalité. Ce protocole est conçu pour une seule tomographie calculée par émission de photons (SPECT) et un protocole d’acquisition de tomographie calculée (CT) à l’aide de collimateurs de corps entier de souris (MWB) dans un système spect/CT double.

Évaluation in vivo de l’autorisation mucociliaire chez la souris

Nous décrivons la méthode d’analyse quantitative de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus (taille de 3 μm) dans les voies respiratoires de souris. La méthode peut également être utilisée pour l’analyse de la distribution des microparticules et des agglomérats de nanoparticules dans les voies respiratoires dans divers modèles d’état pathologique.

Analyse quantitative basée sur la microscopie confocale à balayage laser de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus dans le poumon de souris optiquement nettoyé à montage entier

Ici, nous présentons un protocole pour l’imagerie intravitale d’un Mycobacterium tuberculosis atténué approuvé par BSL-2. Souche dans le poumon murin utilisant une fenêtre pulmonaire permanente. Cette approche permet une analyse longitudinale à résolution unicellulaire des interactions précoces hôte-pathogène, y compris la localisation bacillaire, la dynamique vasculaire et l’absorption des macrophages dans le même microenvironnement pulmonaire.

Imagerie intravitale de Mycobacterium tuberculosis auxotrophe atténué dans le poumon murin lors d’une infection intravasculaire précoce

Découvrez une méthode d'imagerie pulmonaire chez la souris préservant la position naturelle des spores fongiques dans les voies aériennes. Cette approche permet une analyse précise par microscopie à fluorescence des interactions hôte-pathogène.

Méthode efficace d’imagerie des poumons murins qui préserve la dynamique spatiale des spores fongiques dans les voies respiratoires (Vidéo) | JoVE Journal

Méthode efficace d’imagerie des poumons murins qui préserve la dynamique spatiale des spores fongiques dans les voies respiratoires

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