Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés pour l’étude de la fonction des gènes

Mon groupe s’intéresse aux mécanismes qui régulent l’expression des gènes dans les cellules progénitrices neurales du néocortex en développement. Et en particulier, nous nous concentrons sur les mécanismes épigénétiques. Ceux-ci sont importants pour le potentiel des cellules progénitrices neurales à proliférer et à se différencier, et donc pour le bon développement et le bon fonctionnement du cerveau.

Les organoïdes corticaux sont de nouveaux modèles passionnants qui nous permettent d’étudier le développement du cerveau humain. Ils nous permettent également de modéliser le développement d’autres espèces de primates. Dans ce protocole, nous décrivons l’électroporation d’organoïdes corticaux humains pour étudier la fonction des gènes.

Les organoïdes sont découpés à l’aide d’un vibratome, ce qui les rend particulièrement accessibles pour l’injection et l’électroporation. L’électroporation d’organoïdes corticaux humains représente une technique puissante pour étudier la fonction des gènes. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier le facteur de croissance EPIREGULIN, qui est impliqué dans le développement et l’évolution du cerveau.

Nous avons également utilisé la méthode pour étudier l’activité des régions d’amplification de différentes espèces de primates. Pour commencer, intégrez les organoïdes corticaux humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans 3 % d’agarose à bas point de fusion. Coupez les organoïdes d’un vibratome en sections de 500 micromètres d’épaisseur.

Après le tranchage, poursuivre la culture des organoïdes dans une plaque d’attache ultra-basse à six puits contenant quatre cerveaux dont trois sur un agitateur orbital à 120 tr/min. Ensuite, réglez l’extracteur de microcapillaires sur les paramètres spécifiés pour tirer les capillaires en verre borosilicaté pour les injections. Après avoir tiré, rangez les capillaires dans une grande boîte de Pétri et fixez-les avec du ruban adhésif.

Le jour de l’électroporation, préchauffez la solution de Tyrode à 37 degrés Celsius et préparez le CRISPR Cas9 RNP à une concentration finale de 24 micromolaires. Ajouter le plasmide pCAG-GFP et une solution Fast Green à 0,1 % dans l’eau au mélange d’injection final. Sélectionnez les organoïdes corticaux humains avec des structures ventriculaires bien développées et jetez les organoïdes qui n’ont pas ces structures.

Transférez jusqu’à 10 organoïdes dans une boîte de Pétri de 6 centimètres contenant la solution de Tyrode. À l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur, remplissez un microcapillaire en verre avec 10 microlitres de la solution d’injection. Ouvrez le capillaire en pinçant l’extrémité fine à l’aide d’une pince à épiler.

Vérifiez si le capillaire est ouvert en libérant une partie du mélange d’injection dans la solution de Tyrode. Insérez le capillaire au centre des structures en forme de ventricule et appuyez sur l’interrupteur au pied d’un micro-injecteur pour injecter 0,2 à 0,5 microlitre du mélange. Utilisez des pinces fines pour pousser l’organoïde afin de restreindre son mouvement sans le saisir.

Après l’injection, à l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre, transférez un à deux organoïdes injectés dans une chambre d’électroporation contenant la solution de Tyrode. Orientez les organoïdes injectés vers les électrodes, en veillant à ce que la glie radiale apicale et les régions ressemblant à des ventricules soient tournées vers l’extérieur. Fixez les câbles à la chambre d’électroporation avec le côté injecté de l’organoïde face au pôle positif.

Appuyez sur le bouton Pulse de l’électroporateur pour délivrer cinq impulsions de 38 volts pendant 50 millisecondes chacune à des intervalles de 1 seconde. Après l’électroporation, ramenez les organoïdes corticaux humains dans le milieu quatre cerveaux trois, et cultivez-les sans secouer pendant 24 heures. Après la fixation et la cryosection d’organoïdes corticaux humains électroporés, effectuer le prélèvement d’antigènes dans un tampon de citrate pendant une heure à 70 degrés Celsius dans un bain-marie pour une analyse immunohistochimique.

Lavez les sections une fois dans PBS pendant cinq minutes. Ensuite, séchez brièvement les lames et utilisez un stylo à cire pour entourer les sections. Trempez les sections avec 0,1 molaire de glycine dans du PBS pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez les sections deux fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Ajoutez un tampon de blocage sur les sections et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, incubez la section dans des anticorps primaires pendant la nuit à 4 degrés Celsius.

Le lendemain, lavez les sections trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Incuber les sections avec des anticorps secondaires et du DAPI dans un tampon de blocage pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé la section avec du PBS, montez la lame avec un support de montage et imagez les sections à l’aide d’un microscope fluorescent.

L’immunohistochimie des organoïdes électroporés a révélé plusieurs ventricules ciblés au sein d’un organoïde cortical électroporé avec des électroporations optimales ciblant les structures de type ventricule situées dans les régions externes de l’organoïde. Un dépannage est nécessaire si une mort cellulaire excessive est observée. Cela peut être causé par des concentrations élevées de plasmides ou des paramètres d’électroporation sous-optimaux.

Les électroporations orientées vers l’intérieur de l’organoïde sont souvent plus difficiles à interpréter en raison des zones ressemblant à des plaques corticales qui fusionnent avec les ventricules adjacents. Une perturbation de la surface apicale peut se produire lorsqu’un volume d’injection excessif ou de fortes impulsions électriques sont appliqués, entraînant des ruptures du ventricule et une délamination cellulaire. L’inactivation de la protéine PCGF4 du complexe répressif Polycomb 1 a été confirmée par l’immunohistochimie, montrant une réduction de l’intensité du signal dans les cellules positives à la GFP.

L’analyse de l’intensité du signal des cellules GFP positives a révélé une réduction significative des niveaux de protéine PCGF4 dans les échantillons knock-out par rapport aux témoins.