Name: Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés pour l’étude de la fonction des gènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Découvrez l'électroporation d'organoïdes corticaux humains tranchés pour étudier la fonction des gènes et les mécanismes épigénétiques. Cette technique permet d'explorer le développement cérébral et les troubles neurodéveloppementaux.

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<meta charset="utf8"></head><body>Inactivation du gène CRISPR/Cas9 dans des organoïdes corticaux humains tranchés par électroporation

<table><tbody><tr><td>Tubes à centrifuger en PP de 15 ml, cônes</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>unité centrale 4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X Unit</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube à fond rond en polystyrène de 5 mL avec capuchon de filtre à cellules</td><td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>plaque à 6 puits, traité Nunclon</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td>pour hiPSC culture</td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits, fixation ultra faible</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Pour la culture d’organoïdes</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>Forebrain medium 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Compresseur d’air</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-545-155</td><td>Anticorps secondaire, RRID : AB_2340375 ; dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Anticorps secondaire, RRID : AB_162543 ; dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td><td>Technologies</td><td></td> d’ADN intégrées <td>Conception personnalisée (commander en tant que 2 nmol)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>Technologies ADN intégrées</td><td>1081060</td><td>100 & micro ; g, de Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Amphotéricine B (Fungizone)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Cerveau antérieur milieu 2, 3 et 4&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-GFP (poulet, polyclonal)</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID : AB_300798 ; dilution 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-PCGF4 (souris, monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>05-637&nbsp ;</td><td>RRID : AB_309865 ; dilution 1:300</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent ApoTome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>Forebrain medium 4&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</sup</td></tr><tr><td>>B27-supplément (+ vitamine A)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Forebrain medium 3, 4&nbsp ; &nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Banana to Micrograbber</td><td>Cable Kit Harvard Apparatus BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Thermocycler (machine PCR)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires, verre borosilicate avec filament, OD 1,2 mm ; ID 0,69 mm ; 10 cm de longueur</td><td>Science Products</td><td>BF120-69-10</td><td>Besoin d’être tiré à une épaisseur spécifique</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td>Forebrain medium 2&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Collagénase de type IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>Installation d’ingénierie des cellules souches au CMCB DD https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td></td><td>Lignée hiPSC adaptée à un seul cellulaire à partir de DAPI de donneur sain</td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>stock de 1 mg/mL, utiliser 1:1000 dilué pour</td></tr><tr><td>IF Dibutyryl-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>Cerveau antérieur moyen 4&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Forebrain medium 1, 2 et 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorphine</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>Forebrain medium 1&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 Pince, droite, 11 cm</td><td>Outils de science fine</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Système d’électroporation à ondes carrées</td><td>Appareil Harvard BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp ;</td><td>SH30070.03&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette flamboyant/brun</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Pour l’extraction de microcapillaires</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>Software version 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</td><td>Kalebic et al., 2016 ; Platt et al., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG ; nucléotides soulignés = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>35050038</td><td>Cerveau antérieur milieu 1, 2, 3 et 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>cet article</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (correspond aux images KO de la figure 3I+J)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>cet article</td><td></td><td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (correspond à l’image KO images de la figure 3I+J)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>fabriqué en maison</td><td></td><td>1 M stock</td></tr><tr><td>Sérum de cheval, Gibco inactivé par la chaleur</td><td></td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Protéine recombinante GDNF humaine</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Cerveau antérieur moyen 4&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Humain/Souris/Rat BDNF Protéine recombinante</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-02</td><td>Cerveau antérieur moyen 4&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>Pour fabriquer TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge (wax)</td><td>Pen Vector Laboraories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’insuline humaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp ; I9278</td><td>Cerveau antérieur moyen 3&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Knockout</td><td>Serum Replacement Gibco&nbsp ;</td><td>10828-010</td><td>Cerveau antérieur moyen 1&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Balayage laser Microscope confocal 980 Agarose</td><td></td> à faible point de fusion Zeiss<td></td><td></td></tr><tr><td>, 16520100</td><td>Thermo Fisher</td><td></td> ultra pure <td>pour l’intégration de hCOs lors de la coupe par vibratome</td></tr><tr><td>Matrigel Matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit (GFR), sans LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Pour la culture d’organoïdes</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, sans LDEV</td><td></td><td>Corning 354277</td><td>Pour la culture hiPSC</td></tr><tr><td>MgCl2, 1 M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur PicoPump + Pédale</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Pipette Tips 0,5 à 20 &micro ; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Pour le chargement de capillaires en verre</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Milieu de cellules souches</td></tr><tr><td>N-2 supplément Gibco</td><td></td><td>17502048</td><td>Forebrain medium 2 et 3&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Chambre de comptage</td><td>Marque</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Forebrain medium 4&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>11140050</td><td>Milieu du cerveau antérieur 1, 2, 3 et 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Tampon duplex sans nucléase</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>O. C. T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Milieu d’enrobage pour échantillon de tissu congelé</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Moule d’enrobage tronquéT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>Pour l’enrobage de hCO pour le vibratome et la cryosection</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Forebrain medium 1, 2, 3 et 4&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 et pour milieu de cellules souches après nucléofection</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 60 mm x 15 mm, sans évent, stérile</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri Chambre d’électrode en platine, espace de 5 mm</td><td>Appareil de Harvard BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>fabriquée en interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>D’après l’album Titrachium ; 10 mg/mL stock</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la voie RHO/ROCK (Y-27632)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>Cerveau antérieur moyen 2&nbsp ; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Citrate de sodium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus lames d’adhérence</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>SZX10 avec une KL 300 LED</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>ou un stéréoscope alternatif</td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>alias Octoxinol 9</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>Pour fabriquer TrisHCl</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>Dissociation enzmye pour fabriquer des suspensions unicellulaires</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>alias Polysorbate 20</td></tr><tr><td>Sel de Tyrode</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>Vibrant Microtome (vibratome)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Wide-Bore 1000 &micro ; L Embouts Filtrants Universels</td><td>Corning</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>21985-023</td><td>Cerveau antérieur moyens 1, 3 et 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés pour l’étude de la fonction des gènes

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

L’ablation génique médiée par CRISPR/Cas9 nécessite la conception d’ARNg. Généralement, le ciblage de l’un des premiers exons d’un gène d’intérêt avec une paire d’ARNg espacés de 7 à 11 pb (en évitant les multiples de 3 pb) fonctionne bien (Figure 1A). Comme premier test, l’efficacité de la reconnaissance de la matrice par les ARNg peut être interrogée in vitro à l’aide d’une matrice PCR 26,40,62. Un ciblage efficace et une coupe médiée par Cas9 sont visibles dans la réduction de l’ADN matrice et l’apparition de produits d’ADN clivés sur un gel d’agarose (Figure 1B). D’autres tests d’ARNg peuvent être effectués dans la lignée iPSC utilisée pour la génération d’organoïdes corticaux. Cela nécessite la nucléofection des iPSC, qui peuvent être visualisées par une expression rapporteuse fluorescente réussie (Figure 1C). L’efficacité du ciblage du locus d’intérêt peut être vérifiée par le séquençage de Sanger, ce qui aboutit à un chromatogramme qui se termine brusquement ou se superpose autour du site de ciblage (Figure 1D), résultant d’un spectre d’indels provenant de la réparation de cassures double brin par jonction d’extrémité non homologue66. Les tests d’efficacité de l’ARN Guide in vitro et dans les cellules iPSC aident à sélectionner des paires d’ARNg efficaces pour l’ablation de gènes dans les organoïdes corticaux.
Avant l’électroporation, les organoïdes corticaux sont tranchés, ce qui permet d’identifier les lumières du ventricule pour l’injection du mélange d’électroporation (Figure 2A-C). Les organoïdes injectés sont ensuite transférés dans la chambre d’électroporation (Figure 2D). Pour l’électroporation, il faut utiliser des organoïdes corticaux avec des structures ventriculaires bien développées (Figure 2E), tandis que les organoïdes corticaux dépourvus de structures visibles doivent être écartés (Figure 2F). Le mélange d’électroporation contient un colorant qui permet de visualiser les ventricules injectés pendant la procédure (Figure 2G). Après 1 à 3 jours de culture, les ventricules ciblés avec succès sont visibles par le signal GFP natif sous un microscope fluorescent (Figure 2H).
Pour une analyse histologique approfondie, l’immunohistochimie des cryosections peut être réalisée. Idéalement, plusieurs ventricules ciblés sont présents dans un organoïde cortical électroporé (Figure 3A,B). Les électroporations les plus optimales ciblent les structures semblables à celles d’un ventricule dans la région externe de l’organoïde faisant face à l’extérieur (Figure 3C), car ce sont généralement les ventricules les plus élargis. Dans certains cas, l’électroporation peut entraîner une mort cellulaire excessive (Figure 3D,E), par exemple, lorsque les concentrations de plasmides sont trop élevées ou que les paramètres d’électroporation ne sont pas optimaux. Les électroporations orientées vers l’intérieur de l’organoïde (Figure 3F) impliquent souvent des régions moins étendues des structures de type ventricule par rapport à l’extérieur. D’après notre expérience, il est utile de concentrer l’analyse quantitative sur des régions définies de l’organoïde pour réduire la variabilité. Parfois, l’électroporation peut provoquer une perturbation de la surface apicale (Figure 3G), par exemple, lorsque le volume d’injection est trop élevé, provoquant une rupture des ventricules, ou lorsque les impulsions électriques sont trop fortes, entraînant une délamination cellulaire. Enfin, lorsque deux ventricules adjacents sont ciblés (Figure 3H), il peut devenir difficile d’attribuer les limites des zones corticales et l’origine des cellules ciblées.
L’immunohistochimie peut être utilisée pour vérifier le succès de l’inactivation médiée par CRISPR/Cas9 au niveau de la protéine dans les cellules d’intérêt (Figure 3I), illustré ici par le ciblage de la protéine PCGF467 du Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1). L’intensité du signal peut être analysée dans des cellules GFP positives dans des conditions de contrôle par rapport aux conditions expérimentales (Figure 3J). Alternativement, si aucun anticorps approprié n’est disponible, les cellules ciblées peuvent être isolées par FACS à partir d’organoïdes corticaux60 et analysées plus en détail par Sanger ou Next Generation Sequencing36. De plus, la réduction des niveaux de protéines peut également être analysée à l’aide du Western blot.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg"> 
Figure 1 : Conception et validation de l’ARN guide pour l’inactivation aiguë du gène médiée par CRISPR/Cas9. (A) Illustration schématique de la stratégie de conception de l’ARN guide (ARNg), avec deux ARNg ciblant un exon d’un gène d’intérêt. Les flèches noires indiquent les amorces PCR pour la préparation des matrices utilisées pour la validation de l’ARNg. (B) Validation de l’efficacité de l’ARNg in vitro. Les matrices amplifiées par PCR ont été digérées avec des complexes RNP. Lors d’un clivage réussi, deux bandes de tailles différentes sont visibles après l’électrophorèse sur gel (à gauche), tandis que le modèle reste non coupé pour les ARNg à faible efficacité (à droite). (C) Image en fond clair (à gauche), fluorescence GFP (au milieu) et images fusionnées (à droite) de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) 3 jours après la nucléofection avec le complexe RNP et un plasmide GFP. Barres d’échelle : 350 μm. (D) Validation de l’efficacité de l’ARNg dans les hiPSC par séquençage de Sanger de l’ADN amplifié à partir de cellules GFP positives. Lors du clivage réussi de l’ADN double brin, les pistes de séquençage montrent des signaux superposés à partir du site cible de l’ARNg (en haut, KO1). En cas d’échec du ciblage, la trace de séquence d’ADN reste inchangée (en bas, KO2) par rapport au contrôle LACZ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg"> 
Figure 2 : Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés. (A) Illustration schématique montrant le flux de travail pour l’électroporation d’organoïdes corticaux humains (hCO). Tout d’abord, les hCOs sont coupés en tranches de 500 μm d’épaisseur. Deux jours plus tard, le mélange RNP contenant un plasmide d’expression de GFP et Fast Green est injecté dans les lumières de structures de type ventricule, préférentiellement dans la région externe des hCO. Pour l’électroporation, les hCO sont placés dans la chambre d’électroporation. Après plusieurs jours de culture, un signal GFP peut être détecté dans les zones électroporées. (B) Images de coupe vibratome de hCOs. Les organoïdes sont noyés dans 3 % d’agarose à bas point de fusion dans un milieu en bloc (à gauche). Le bloc est coupé en tranches de 500 m d’épaisseur (au milieu). Les organoïdes tranchés sont transférés dans la boîte de culture à l’aide d’une pointe de pipette à large alésage (à droite). (C) Images montrant l’injection du mélange contenant le RNP, le pCAG-GFP et 0,1 % de Fast Green dans les structures ventriculaires des organoïdes. Les organoïdes sont immergés dans la solution de Tyrode et le mince capillaire de verre est inséré dans la lumière du centre des structures en forme de ventricule (à gauche). Les pinces sont utilisées pour stabiliser les organoïdes (gauche et milieu). Les ventricules à l’extérieur des organoïdes sont ciblés (au milieu). Les organoïdes injectés sont transférés dans la chambre d’électroporation, ou plus tard dans la boîte de culture, avec des pointes de pipette à large diamètre (à droite). (D) Images de la chambre d’électroporation, qui est composée d’une boîte de Pétri en verre et de deux lames métalliques collées au verre. Les lames métalliques servent d’électrodes et contiennent des trous pour fixer les câbles à connecter à l’électroporateur. La face injectée du hCO, visible à travers une ombre verte, doit faire face à l’anode (pôle positif, câble rouge) (à droite). (E) Images représentatives des hCOs montrant des structures bien développées ressemblant à des ventricules. L’anneau plus clair représente la zone ventriculaire. Le cercle plus foncé au centre de la structure en forme de ventricule représente la lumière et doit être ciblé pour l’injection. (F) Des images représentatives d’hCOs dépourvues de structures ventriculaires bien développées, que nous recommandons de ne pas inclure pour d’autres expériences. (G) Images représentatives des hCO après injection du mélange d’électroporation, dans lesquelles les zones ciblées sont visibles en vert rapide (flèches orange). (H) Image représentative de hCO montrant le signal GFP natif 24 h après l’électroporation. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg"> 
Figure 3 : Analyse immunohistochimique d’organoïdes corticaux humains tranchés électroporés. (A) Schéma représentant un organoïde cortical humain électroporé (hCO) avec un signal fluorescent vert. (B) Coloration DAPI (gris) et immunofluorescence pour GFP (vert) d’un hCO cryosectionné avec plusieurs ventricules électroporés, 7 jours après l’électroporation. (C-H) Exemples d’images de différents résultats d’électroporation, colorés pour la GFP (vert) et les noyaux (DAPI, gris). (C) Une électroporation optimale avec des noyaux intacts (voir encadré 1, D), une structure ventricule non interrompue et des cellules électroporées dans la zone orientée vers l’extérieur de l’organoïde, qui est généralement la plus dilatée. (E) Exemple de hCO présentant une mort cellulaire massive dans la zone électroporée (voir aussi encadré 2, D), caractérisée par de petits noyaux denses en DAPI et déformés. (F) Une électroporation réussie dirigée vers l’intérieur de l’organoïde, qui est souvent plus difficile à interpréter en raison des zones ressemblant à des plaques corticales qui fusionnent avec les ventricules adjacents. (G) Structures ventriculaires perturbées au centre de la zone électroporée (flèche orange). (H) Un exemple de hCO contenant plusieurs ventricules plus petits qui sont partiellement fusionnés et, par conséquent, difficiles à quantifier. (I) Coloration DAPI (gris) et immunofluorescence pour GFP (vert) et PCGF4 (magenta) 7 jours après électroporation d’un complexe RNP ciblant LACZ (gLACZ KO, à gauche) ou PCGF4 (gPCGF4 KO, droite) pour l’inactivation médiée par CRISPR/Cas9. Les cellules encerclées mettent en évidence l’intensité réduite de PCGF4, indiquant une ablation génique réussie. Un signal uniforme peut être vu dans la commande LACZ (à gauche). (J) Le graphique montre l’intensité quantifiée de PCGF4 après immunofluorescence dans les cellules positives à la GFP pour le contrôle (gLACZ KO) et la KO de PCGF4 (gPCGF4 KO) par rapport à l’expression médiane de PCGF4 dans la condition gLACZ. Chaque point représente une cellule. Données provenant de 3-4 organoïdes de deux lots différents (gris et noir) de la même lignée hiPSC. p &lt; 0,0001, test de Mann-Whitney. Toutes les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal (B, C) ou fluorescent (E-I) à balayage laser. Les images représentent des projections d’intensité maximale de piles z de 10 à 15 m d’épaisseur. Les lignes pointillées blanches indiquent la surface apicale faisant face à la lumière du ventricule et les surfaces externes des hCO. Les lignes pointillées orange indiquent la bordure VZ/SVZ dans les ventricules fusionnés. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorps/colorant</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poulet anti-GFP</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souris anti-PCGF4</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Âne Anti-Poulet</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Âne Anti-Lapin</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1 mg/mL de stock ; 1:1,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Liste des anticorps et colorants et de leur dilution utilisés pour la coloration par immunofluorescence.

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette procédure décrit une méthode pour l'isolement et la culture de l'organe de Corti murin avec ou sans le limbe en spirale et les neurones du ganglion spiral. Nous démontrons également une méthode pour l'expression d'un gène rapporteur exogènes dans l'organe de Corti explant par électroporation.

Culture primaire et l&#39;électroporation plasmidique de l&#39;Organe de Corti murin.

Électroporation in utero est une méthode utile pour transfecter des cellules progénitrices neuronales in vivo. Selon le placement des électrodes et la période de développement de l'électroporation, certains sous-ensembles de cellules corticales peuvent être ciblées. Cellules ciblées peuvent ensuite être analysées in vivo ou in vitro des effets de l'altération génétique.

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

Pour procéder à une évaluation rapide de la fonction des gènes dans le développement du cortex cérébral, nous décrivons des procédés impliquant...

Méthodes pour l&#39;étude de la morphogenèse neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Électroporation ARNi dans embryonnaire cortex cérébral murin

Cette vidéo démontre le protocole d’électroporation unicellulaire de gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs à travers une gamme de cultures de coupes d’hippocampe in vitro. Cette technique est utile pour examiner les fonctions moléculaires et physiologiques spécifiques des neurones, y compris les mécanismes d’autonomie cellulaire et les interactions transsynaptiques entre les protéines.

Électroporation de cellules uniques dans des cultures de tranches de cerveau organotypiques : une technique in vitro pour délivrer des plasmides à l’intérieur de neurones ciblés dans des coupes d’hippocampe cérébral

Ce protocole décrit une procédure d'explantation amélioré qui...

Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

L’électroporation double in utero permet de cibler les populations cellulaires qui sont séparées spatialement et temporellement. Cette technique est utile pour visualiser les interactions entre ces populations cellulaires à l’aide de protéines fluorescentes dans des conditions normales, mais aussi après des expériences fonctionnelles pour perturber les gènes d’intérêt.

Double électroporation in utero pour cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement

Présenté ici est un protocole pour l’électroporation unicellulaire qui peut livrer des gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs à travers une gamme d’âges in vitro de culture de tranche hippocampique. Notre approche fournit une expression précise et efficace des gènes dans des cellules individuelles, qui peuvent être utilisées pour examiner les fonctions cellulaires autonomes et intercellulaires.

Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe

L’électroporation des organoïdes cérébraux des primates fournit une approche précise et efficace pour introduire des modifications génétiques transitoires dans différents types de progéniteurs et de neurones dans un système modèle proche du développement du néocortex (patho)physiologique des primates. Cela permet l’étude des processus neurodéveloppementaux et évolutifs et peut également être appliqué à la modélisation des maladies.

Microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique

Cultures embryonnaires de cellules rétiniennes chiches constituent des outils précieux pour l'étude de la biologie photorécepteur. Nous avons mis au point une technique de transfert de gène efficace sur la base de plasmide électroporation ex ovo de la rétine antérieure à la culture. Cette technique augmente considérablement les efficacités de transfection sur des protocoles actuellement disponibles, ce qui rend possible une manipulation génétique pour ce système.

Efficient Gene Transfer dans Chick rétines pour cellulaires primaires études sur la culture: Un Ex-ovo Approche d'électroporation

Nous présentons une méthode qui décrit l’isolement et la culture d’explants cochléaires à partir d’oreilles internes embryonnaires de souris.  Nous démontrons également une méthode de transfert de gènes dans des explants cochléaires par électroporation à ondes carrées. La culture d’explants in vitro couplée à la technique de transfert de gènes permet aux chercheurs d’étudier les effets de la modification de l’expression des gènes au cours du développement.

Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

Découvrez l'électroporation d'organoïdes corticaux humains tranchés pour étudier la fonction des gènes et les mécanismes épigénétiques. Cette technique permet d'explorer le développement cérébral et les troubles neurodéveloppementaux.

Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés pour l’étude de la fonction des gènes

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