Purification, expansion et phénotypage basé sur la cytométrie en flux de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse dérivées de souris
11 juillet 2025
Le présent protocole décrit une méthode rentable pour purifier, étendre et caractériser des cellules souches mésenchymateuses (BMSC) de moelle osseuse hautement homogènes provenant de souris. Cette approche facilite l’acquisition de grandes quantités de BMSC à fort potentiel de prolifération et de différenciation, soutenant les modèles murins et faisant progresser la recherche préclinique.
Notre recherche fournit une méthode peu coûteuse pour purifier et étendre les cellules souches mésenchymateuses homogènes de la moelle osseuse de souris. Cela aide les chercheurs à obtenir suffisamment de cellules de haute qualité avec de fortes capacités de croissance et de différenciation. L’un des principaux défis de la recherche sur les cellules souches de la moelle osseuse est la mise au point d’un protocole simple et efficace pour isoler les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse. Cette méthode permet aux cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de se développer latéralement en évitant les perturbations. Il utilise le troisième passage, évite les effets de croissance supplémentaires et maintient les cellules hématopoïétiques pour soutenir la santé et la fonction des cellules souches.
[Instructeur] Pour commencer, faites tremper la souris euthanasiée dans de l’éthanol à 75 % pendant cinq minutes. À l’aide de ciseaux de dissection stériles, faites une incision d’environ un centimètre au niveau du membre postérieur, près du tendon d’Achille. Ensuite, effectuez une incision circulaire autour du membre postérieur pour exposer le tibia distal. Pelez la peau du site d’incision vers le haut vers la hanche pour retirer la peau des deux membres postérieurs. Coupez le long de l’os iliaque pour détacher la tête fémorale de l’os de la hanche. À l’aide d’un scalpel stérile, retirez autant de tendons et de muscles que possible du tibia et du péroné pour faciliter les rougeurs ultérieures. Remettez les os nettoyés dans la boîte contenant du PBS avec 2 % de pénicilline et de streptomycine avant de les déplacer dans une hotte stérile. Prenez une seringue de 50 millilitres et fixez-y l’aiguille fournie avec la seringue. Remplissez la seringue avec 20 millilitres de milieu alpha MEM et remplacez l’aiguille par celle fournie avec la seringue d’un millilitre. Dans le capuchon stérile, utilisez des ciseaux pour couper les deux extrémités du fémur ou du tibia séparé. Maintenant, insérez l’aiguille dans l’os au niveau du bord coupé et rincez la moelle osseuse dans une boîte de culture cellulaire de 100 millimètres contenant un milieu alpha MEM complet. Continuez à rincer jusqu’à ce que l’os devienne visiblement pâle, indiquant une extraction de moelle réussie. Pipetez vers le haut et vers le bas 40 fois à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre pour disperser tous les agrégats cellulaires. Maintenant, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres dans un tube de centrifugation de 50 millilitres pour éliminer les débris, les fragments de tissus et les amas non dispersés. Ajustez le volume total à 15 millilitres avec un milieu alpha MEM complet et transférez la suspension cellulaire filtrée dans une boîte de culture de 100 millimètres. Tenez le plat à deux mains et faites-le tourner doucement 15 fois dans un mouvement en huit pour répartir uniformément les cellules sur le plat. Enfin, placez la boîte de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et cultivez pendant cinq jours. Cette figure illustre la progression morphologique des cellules stromales de la moelle osseuse depuis l’extraction initiale jusqu’au troisième passage en culture. Les cellules de moelle osseuse fraîchement extraites semblaient principalement mononucléaires, avec des gouttelettes de graisse éparpillées visibles dans tout le champ. Au cinquième jour de culture, les cellules fusiformes ont commencé à émerger et ont atteint une confluence d’environ 60 % à 80 %, continuant d’augmenter en densité au septième jour. Du passage un au passage trois, les cellules stromales de la moelle osseuse ont conservé une morphologie fusiforme ou fusiforme, ont formé une monocouche claire avec des colonies interconnectées et n’ont montré aucun signe d’apoptose tel que la granularité cytoplasmique ou la fragmentation nucléaire. La cytométrie en flux a confirmé que CD29, CD44 et Sca-1 étaient fortement exprimés dans les cellules stromales de la moelle osseuse. L’expression des marqueurs CD31 et CD45 des lignées endothéliales et hématopoïétiques était négligeable. La quantification des marqueurs a en outre confirmé les niveaux d’expression élevés de CD29, CD44 et Sca-1 par rapport à CD31 et CD45.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode économique pour purifier et amplifier des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSCs) hautement homogènes provenant de souris. Le protocole simplifie non seulement le processus d'isolement, mais améliore également les capacités de prolifération et de différenciation des BMSCs obtenues, ce qui fait progresser la recherche préclinique utilisant des modèles murins.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Recherche sur les cellules souches
- Modèles précliniques
Contexte
- Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse jouent un rôle crucial en médecine régénérative.
- Des CSMO homogènes sont essentielles pour des résultats expérimentaux fiables.
- Des protocoles rentables sont nécessaires pour faciliter un accès élargi à la recherche.
Méthodes utilisées
- Techniques d'extraction et de culture de la moelle osseuse.
- Modèle murin pour l'obtention de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSCs).
- Cytométrie en flux pour la caractérisation cellulaire.
Résultats principaux
- Le protocole a permis d'obtenir des CSMO présentant un fort potentiel de croissance et de différenciation.
- Les CSMO ont conservé une morphologie constante en fuseau ou fusiforme au cours des passages.
- La cytométrie en flux a confirmé une forte expression des marqueurs des cellules souches, CD29, CD44 et Sca-1.
Conclusions
- Cette étude démontre avec succès une méthode fiable pour l'isolement des CSMO qui soutient les recherches ultérieures.
- Les résultats sont pertinents pour améliorer la reproductibilité et l'efficacité des applications des cellules souches en biologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La purification fiable et l'expansion de cellules souches mésenchymateuses homogènes de moelle osseuse murine (BMSCs) sont essentielles au développement de modèles précliniques et à la recherche translationnelle. Ce protocole permet une production reproductible de BMSCs de haute qualité dotées de phénotypes validés, soutenant ainsi une validation robuste des cibles et une réduction des risques mécanistiques en phase initiale de découverte. Des protocoles standardisés pour les BMSCs réduisent la variabilité biologique, renforçant la fiabilité prédictive à travers les portefeuilles de recherche et développement.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'isolement reproductible de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSCs) pour l'analyse d'hypothèses ciblant des voies spécifiques.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles en fournissant des populations cellulaires homogènes et bien caractérisées.
- Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les modèles in vitro pertinents pour les maladies.
- Facilite le tri des projets en assurant des entrées biologiques cohérentes pour le criblage.
Développement de tests et criblage
- Permet d'obtenir des préparations normalisées de CSMO pour le développement de tests en aval.
- Améliore la reproductibilité des tests et la fiabilité des résultats quantitatifs grâce à une validation phénotypique.
- Permet une expansion évolutive des CSMO pour des plateformes de criblage à haut débit.
- Facilite une évaluation robuste des composés en réduisant l'hétérogénéité de la population cellulaire.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les modèles précliniques pertinents pour la maladie en fournissant des populations de cellules souches validées.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique grâce à une qualité cellulaire constante.
- Réduit les risques dans les études translationnelles en confirmant le potentiel de différenciation et de prolifération.
- Facilite l'alignement des biomarqueurs par des analyses phénotypiques basées sur la cytométrie en flux.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et le développement de modèles précliniques, fournissant une base pour l'identification de composés candidats et la recherche translationnelle.
- Biologie de la découverte : Permet des tests d'hypothèses rigoureux et la clarification des voies à l'aide de BMSC homogènes.
- Écrans : Fournit des cellules prêtes à l'essai et validées sur le plan phénotypique pour des protocoles d'écran reproductibles.
- Analytique : Utilise la cytométrie en flux pour générer des données quantitatives d'expression des marqueurs permettant la comparaison entre conditions.
- Recherche translationnelle : Fait le lien entre les découvertes et les études précliniques grâce à des populations de cellules souches multipotentes validées.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un protocole standardisé et évolutif utilisable de façon répétée dans différents programmes de R&D.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit les risques biologiques dans les recherches en phase précoce.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation, la reproductibilité et l'extensibilité des protocoles utilisant les cellules souches mésenchymateuses du sang du cordon (BMSC).
- Valeur stratégique : Permet des décisions éclairées de type « poursuivre/interrompre » et favorise une avancée du portefeuille de projets efficace en termes de capital.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en fournissant des données fiables issues de modèles précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en technique stérile et en analyse par cytométrie en flux.
- Suppose l'accès à une infrastructure de culture cellulaire et à des instruments analytiques.
- Exige une standardisation interéquipes pour une préparation et un phénotypage cellulaires cohérents.
- Adaptable à diverses souches de souris, mais peut nécessiter une optimisation pour d'autres espèces.
- Le rendement et l'homogénéité dépendent d'une stricte adhérence aux étapes du protocole.
