Purification, expansion et phénotypage basé sur la cytométrie en flux de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse dérivées de souris

Notre recherche fournit une méthode peu coûteuse pour purifier et étendre les cellules souches mésenchymateuses homogènes de la moelle osseuse de souris. Cela aide les chercheurs à obtenir suffisamment de cellules de haute qualité avec de fortes capacités de croissance et de différenciation. L’un des principaux défis de la recherche sur les cellules souches de la moelle osseuse est la mise au point d’un protocole simple et efficace pour isoler les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse. Cette méthode permet aux cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de se développer latéralement en évitant les perturbations. Il utilise le troisième passage, évite les effets de croissance supplémentaires et maintient les cellules hématopoïétiques pour soutenir la santé et la fonction des cellules souches.

[Instructeur] Pour commencer, faites tremper la souris euthanasiée dans de l’éthanol à 75 % pendant cinq minutes. À l’aide de ciseaux de dissection stériles, faites une incision d’environ un centimètre au niveau du membre postérieur, près du tendon d’Achille. Ensuite, effectuez une incision circulaire autour du membre postérieur pour exposer le tibia distal. Pelez la peau du site d’incision vers le haut vers la hanche pour retirer la peau des deux membres postérieurs. Coupez le long de l’os iliaque pour détacher la tête fémorale de l’os de la hanche. À l’aide d’un scalpel stérile, retirez autant de tendons et de muscles que possible du tibia et du péroné pour faciliter les rougeurs ultérieures. Remettez les os nettoyés dans la boîte contenant du PBS avec 2 % de pénicilline et de streptomycine avant de les déplacer dans une hotte stérile. Prenez une seringue de 50 millilitres et fixez-y l’aiguille fournie avec la seringue. Remplissez la seringue avec 20 millilitres de milieu alpha MEM et remplacez l’aiguille par celle fournie avec la seringue d’un millilitre. Dans le capuchon stérile, utilisez des ciseaux pour couper les deux extrémités du fémur ou du tibia séparé. Maintenant, insérez l’aiguille dans l’os au niveau du bord coupé et rincez la moelle osseuse dans une boîte de culture cellulaire de 100 millimètres contenant un milieu alpha MEM complet. Continuez à rincer jusqu’à ce que l’os devienne visiblement pâle, indiquant une extraction de moelle réussie. Pipetez vers le haut et vers le bas 40 fois à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre pour disperser tous les agrégats cellulaires. Maintenant, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres dans un tube de centrifugation de 50 millilitres pour éliminer les débris, les fragments de tissus et les amas non dispersés. Ajustez le volume total à 15 millilitres avec un milieu alpha MEM complet et transférez la suspension cellulaire filtrée dans une boîte de culture de 100 millimètres. Tenez le plat à deux mains et faites-le tourner doucement 15 fois dans un mouvement en huit pour répartir uniformément les cellules sur le plat. Enfin, placez la boîte de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et cultivez pendant cinq jours. Cette figure illustre la progression morphologique des cellules stromales de la moelle osseuse depuis l’extraction initiale jusqu’au troisième passage en culture. Les cellules de moelle osseuse fraîchement extraites semblaient principalement mononucléaires, avec des gouttelettes de graisse éparpillées visibles dans tout le champ. Au cinquième jour de culture, les cellules fusiformes ont commencé à émerger et ont atteint une confluence d’environ 60 % à 80 %, continuant d’augmenter en densité au septième jour. Du passage un au passage trois, les cellules stromales de la moelle osseuse ont conservé une morphologie fusiforme ou fusiforme, ont formé une monocouche claire avec des colonies interconnectées et n’ont montré aucun signe d’apoptose tel que la granularité cytoplasmique ou la fragmentation nucléaire. La cytométrie en flux a confirmé que CD29, CD44 et Sca-1 étaient fortement exprimés dans les cellules stromales de la moelle osseuse. L’expression des marqueurs CD31 et CD45 des lignées endothéliales et hématopoïétiques était négligeable. La quantification des marqueurs a en outre confirmé les niveaux d’expression élevés de CD29, CD44 et Sca-1 par rapport à CD31 et CD45.