Évaluation de la signalisation de la mort cellulaire par immunofluorescence dans un modèle d’AVC ischémique chez le rat

L’AVC ischémique est la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde. Nos travaux sont axés sur les cibles médicamenteuses de l’AVC. Nous nous intéressons à plusieurs cibles émergentes, telles que RUNX1 et les cathepsines. Pour évaluer ces cibles, nous avons développé un modèle d’AVC ischémique chez le rat en occlusant l’artère cérébrale moyenne.

Nous modélisons l’AVC ischémique chez le rat en insérant un filament pour occlure l’artère cérébrale moyenne. Le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est le modèle de rongeur le plus couramment utilisé pour les études précliniques sur les accidents vasculaires cérébraux combinées à d’autres techniques, telles que la TTC, l’immunofluorescence et la coloration TUNEL. Nous pouvons explorer la physiopathologie de l’AVC dans une approche intégrée. L’immunofluorescence présente certains défis techniques, tels que la spécificité des anticorps, la minimisation du bruit de fond de fluorescence et l’optimisation du rapport signal/bruit en exploitant les propriétés des marqueurs fluorescents et des anticorps spécifiques. L’immunofluorescence nous permet de comprendre le paysage complexe de l’architecture cellulaire et les interactions moléculaires avec le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne.

Un certain nombre de tissus cérébraux sont potentiellement récupérables avec une fenêtre de temps appropriée de l’AVC. Nos résultats montrent que l’expression de la cathepsine B est activée dans le nombre de cerveaux de rats après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. Elle s’accompagne d’une augmentation de l’apoptose. D’autres études sur le mécanisme sous-jacent à la signalisation de la mort cellulaire pourraient fournir une nouvelle cible pour le médicament.

Dans notre future étude, nous continuerons à explorer des cibles moléculaires potentielles dans les voies inflammatoires et la signalisation de la mort cellulaire. Nous espérons que certaines de ces cibles découvertes par des études expérimentales pourront être traduites en thérapie clinique, améliorant ainsi la survie et la qualité de vie des patients victimes d’un AVC.

[Narrateur] Pour commencer, placez le rat anesthésié en position couchée et maintenez sa température corporelle à 36,5 °C à l’aide d’un tapis chauffant régulé et d’une sonde de surveillance de la température rectale. Rasez la peau du cou et désinfectez-la à l’aide d’une solution désinfectante à l’iodophore. Ensuite, faites une incision médiane de 2 cm dans le cou et rétractez les tissus mous pour exposer les vaisseaux carotidiens. À l’aide d’une pince, isolez l’artère carotide commune droite, l’artère carotide externe, l’artère carotide externe, et l’artère carotide interne, ICA. Lister l’ACC proximal droit à l’aide de sutures. Fixez ensuite l’ICA et l’ECA droits à leur origine à l’aide d’un microclip. Insérez un monofilament de nylon recouvert d’un embout rond en silicone dans la lumière de l’ACC par une petite incision et faites un nœud dans l’ACC pour éviter de saigner et de déloger le monofilament. Ouvrez le microclip ICA droit et insérez le monofilament dans l’artère cérébrale moyenne droite, ou MCA, à travers le moignon ICA jusqu’à ce que l’embout en silicone obstrue l’origine du MCA. Coupez la partie exposée du monofilament de nylon et fermez l’incision médiane du cou. Après deux heures d’occlusion de l’ACM, ouvrez l’incision du cou et défaites le nœud dans l’ACC. Retirez ensuite le monofilament de nylon pour reperfuser le MCA. Après l’opération, observez le rat pendant la récupération de l’anesthésie dans une cage chauffée maintenue avec un tapis chauffant à température régulée. À l’aide de l’échelle d’évaluation comportementale Zaya Long, évaluez la fonction neurologique deux heures après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, ou MCAO, et 22 heures après la reperfusion. Après avoir isolé l’ensemble du cerveau du rat modèle MCAO, congelez le cerveau à -20 °C pendant 20 minutes. Coupez le cerveau congelé en six tranches coronales avec une distance de 2 mm entre les tranches. Teintez les tranches avec 2 % TTC pendant 15 minutes à 37 °C dans l’obscurité. Fixez ensuite les tranches de cerveau avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 24 heures à température ambiante. Photographiez les tranches tachées à l’aide d’un appareil photo numérique réglé sur le mode automatique pour les objets en gros plan. Transférez les images sur un ordinateur et utilisez le logiciel ImageJ pour mesurer la taille de l’infarctus. Calculez la taille de l’infarctus comme le rapport entre la somme de la surface de l’infarctus dans les six tranches et la somme de la surface totale du cerveau dans les mêmes tranches. Des zones d’infarctus significatives ont été observées dans le groupe MCAO, contre aucune zone d’infarctus dans le groupe simulé. Pour l’analyse par immunofluorescence, fixez le cerveau intact du rat modèle MCAO dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 heures. Ensuite, déshydratez le cerveau en une série de gradients de solution de saccharose à des concentrations de 10 %, 15 % et 30 %, à des concentrations de 10 %, 15 % et 30 %, en continuant jusqu’à ce que le tissu coule. Intégrez le cerveau déshydraté dans le composé à température de coupe optimale et éliminez toutes les bulles d’air. Gelez le cerveau dans de l’azote liquide. Sur un cryostat, sectionnez le cerveau à une épaisseur de 5 μm. Après avoir équilibré les sections de cerveau congelées à température ambiante, lavez-les trois fois avec du PBS stérile pendant 5 minutes chacune. Décrivez le tissu à l’aide d’un stylo d’immunohistochimie avant de l’incuber avec 20 μg par mL de protéinase K et 0,3 % de Triton X-100 à température ambiante pendant 10 minutes. Après avoir lavé les sections avec du PBS, appliquez 3 % de BSA sur le tissu délimité et incubez à température ambiante pendant une heure pour le blocage. Remplacez la solution bloquante par l’anticorps primaire approprié et incubez les sections pendant la nuit dans l’obscurité à 4 °C. Le lendemain, lavez les sections trois fois avec du PBS stérile contenant 0,1 % de Tween-20 pendant 5 minutes chacune. Ajoutez l’anticorps secondaire approprié conjugué au fluorophore requis et incubez les sections dans une chambre humidifiée pendant une heure, en les protégeant de la lumière. Après avoir lavé les sections avec du PBS contenant du Tween-20, tachez-les avec un support de montage contenant du DAPPI et couvrez-les avec des lamelles. Sur un microscope à fluorescence, réglez la longueur d’onde d’excitation à 488 nm, la longueur d’onde d’émission à 520 nm et le temps d’exposition à 500 ms pour capturer une section de cerveau colorée iméternité. L’immunoréactivité de la cathepsine B a été significativement augmentée dans le noyau ischémique du groupe MCAO par rapport au groupe placebo. L’immunoréactivité de la cathepsine B était significativement élevée dans le cortex pénomsain du groupe MCAO par rapport au groupe placebo. Aucune différence significative dans l’immunoréactivité de la cathepsine B n’a été observée entre le noyau ischémique et le cortex pénombral. Pour commencer, déshydratez les tranches de cerveau fixées au paraformaldéhyde du rat modèle MCAO en augmentant la concentration d’éthanol pendant 35 à 50 minutes chacune. Traitez ensuite les tranches de cerveau avec l’agent biologique transparent 1 de type essence de térébenthine pendant 35 à 50 minutes, puis avec l’agent nettoyant 2 pendant 35 à 50 minutes jusqu’à ce que le tissu soit complètement transparent. Immergez maintenant des tranches de cerveau dans des supports d’enrobage de 1, 2, 3 et 4 de 60 minutes séquentiellement chacun. Placez les tranches de cerveau dans une cassette d’enrobage, fermez-les hermétiquement et stockez-les dans un entrepôt frigorifique pour la solidification. À l’aide du microtome, coupez le bloc de tissu à 10 μm puis coupez à 5 μm. Laissez les sections de tissu flotter dans un bain-marie à 45 °C pendant 30 secondes, puis transférez-les sur des lames. Après le séchage, déparaffinisez les sections cérébrales dans un agent nettoyant pendant deux cycles de 10 minutes chacun. Ensuite, réhydratez les sections du cerveau en diminuant les concentrations d’éthanol. Maintenant, rincez la section trois fois dans PBS pendant cinq minutes chacune. Après avoir éliminé l’excès d’humidité, ajoutez 100 μL de protéinase K dans chaque section et incubez à 37 °C pendant 20 minutes. Après les lavages par PBS, appliquer 100 μL de tampon d’équilibrage de la désoxynucléotidyltransférase terminale sur chaque échantillon et incuber dans une chambre humidifiée à 37 °C pendant 10 à 30 minutes. Retirez le tampon à l’aide d’un papier absorbant et ajoutez 50 μL de solution de travail d’étiquetage à partir du kit de dosage TUNEL. Ensuite, appliquez la solution de travail DAPPI sur les sections et incubez dans l’obscurité pendant cinq minutes pour contre-colorer les noyaux. Rincez les échantillons au PBS quatre fois pendant 5 minutes chacun. Retirez l’excès de liquide et scellez la glissière avec un support de montage anti-décoloration. Numérisez la lame colorée à l’aide du système d’imagerie multispectrale Vectra Polaris. La coloration TUNEL a montré une augmentation significative de l’apoptose, avec plus de cellules TUNEL-positives dans le cortex pénombral du groupe MCAO par rapport au groupe simulé.