Name: Imagerie et quantification de la morphologie mitochondriale chez C. elegans au cours du vieillissement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Découvrez une méthode standardisée d'imagerie et de quantification de la morphologie mitochondriale chez C. elegans au cours du vieillissement. Cette approche permet d'étudier les changements tissu-spécifiques liés à l'âge.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analyse de la morphologie mitochondriale chez C. elegans

<table><tbody><tr><td>5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUDR)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>F2026-10GMBL</td><td>pour l’inhibition de la prolifération</td></tr><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>pour l’ARNi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>pour les plaques NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>pour les plaques NGM</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>pour plaques NGM</td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>pour l’ARNi</td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>pour plaques NGM</td></tr><tr><td>Microscope confocal.</td><td>Stellaris 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>solvant pour médicaments</td></tr><tr><td>Lames de microscope HistoBond</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td>pour préparation de lames</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>pour</td></tr><tr><td>LB LEICA S7E Lunette de dissection</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>Microscope de dissection standard</td></tr><tr><td>LEICA STELLARIS 5</td><td>Leica</td><td>Microscope</td><td>confocal</td>158101100</tr><tr><td>LEICA THUNDER</td><td>Microscope composé</td><td>Leica</td><td>11525679</td> Sulfate</tr> de <tr><td>magnésium heptahydraté</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>pour plaques NGM, M9</td></tr><tr><td>pL4440 plasmide à vecteur vide</td><td>addgene</td><td>plasmide #1654</td><td>pour plasmide à vecteur vide</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>pour soluble d’eau de Javel</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasique</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>pour plaques NGM</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>pour M9</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>pour les vers paralysants</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>pour plaques NGM, M9</td></tr><tr><td>Hypochlorite de sodium</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>pour solution</td></tr> <tr><td>d’eau de JavelPhosphate de sodium dibasique</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>pour M9</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétracycline</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>pour ARNi</td></tr><tr><td>WOB-L&not ; &AElig ; Pompes à vide sèches, à usage standard, Welch&not ; &AElig ;</td><td>VWR</td><td>80077-612</td><td>pour l’aspiration</td></tr></tbody></table>

imagerie et quantification de la morphologie mitochondriale chez c. elegans au cours du vieillissement

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

C. elegans est un excellent modèle pour l’imagerie mitochondriale en raison de son corps transparent, qui permet d’imager facilement les vers entiers et les animaux vivants sans préparation excessive des échantillons. De plus, la morphologie mitochondriale dans différents tissus peut être facilement visualisée en utilisant des promoteurs spécifiques aux tissus pour exprimer des protéines fluorescentes ciblées sur les mitochondries. Ici, myo-3p (pour les mitochondries musculaires), vha-6p (pour les mitochondries intestinales) et col-19p (pour les mitochondries hypodermiques) ont été utilisés pour stimuler l’expression d’une GFP (séquence de localisation mitochondriale de la protéine ATP-1) ciblée sur les mitochondries. Les mitochondries des muscles de la paroi corporelle de C. elegans présentent une morphologie tubulaire, s’alignant le long des fibres musculaires (myofibrilles) (Figure 1A) ; les mitochondries intestinales présentaient des structures fortement interconnectées, en forme de toile, avec un alignement moins uniforme (Figure 1B) ; et l’hypoderme a des mitochondries tubulaires qui semblent plus arrondies ou de forme ovale par rapport à l’intestin ou au muscle (Figure 1C). La morphologie mitochondriale est généralement cohérente sur toute la longueur du ver dans le muscle et l’intestin, mais l’hypoderme présente quelques différences mineures dans l’interconnexion des mitochondries entre les extrémités proximale et distale du ver. Ainsi, pour obtenir des résultats expérimentaux reproductibles, il est recommandé de se concentrer sur une région spécifique de leur corps. Ici, la zone entre le pharynx et la vulve ~100-200 μm sous le pharynx est systématiquement imagée.
Pour les mitochondries musculaires et hypodermiques, leur imagerie au microscope composé offre une résolution suffisante en raison de la planéité des cellules et des faibles niveaux de lumière floue. Cependant, les mitochondries intestinales sont difficiles à observer avec un microscope composé, car le grand volume de l’intestin limite la résolution en raison d’une grande quantité de lumière floue provenant d’autres sections de l’intestin (Figure 2). Par conséquent, il est recommandé d’imager les mitochondries intestinales sous un microscope confocal pour réduire la lumière floue et visualiser la morphologie mitochondriale appropriée.
La forme des mitochondries est très dynamique et change en fonction de l’environnement métabolique des animaux23 ou même en raison de l’exposition à des rigidités variables du substrat24. Par conséquent, laisser des animaux sur des lames de microscope pendant de longues périodes en l’absence d’une source de nourriture et sur le substrat rigide du verre peut potentiellement avoir un impact sur la morphologie mitochondriale. Ici, cette étude a révélé que les mitochondries des vers se fragmentent après environ 30 minutes sur une lame dans une solution M9, les mitochondries hypodermiques présentant le plus de fragmentation (Figure 3). Par conséquent, l’imagerie des mitochondries doit être effectuée rapidement après la préparation de l’échantillon.
Les produits chimiques qui limitent la mobilité des vers, notamment l’azoture de sodium et le tétramisole, sont couramment utilisés pour l’imagerie en direct de C. elegans, car les vers stationnaires sont nécessaires pour capturer plusieurs sections en Z d’animaux pour l’imagerie 3D. Des études antérieures ont montré que l’exposition à l’azoture de sodium ou au tétramisole peut entraîner une fragmentation mitochondriale25. Étonnamment, il a été constaté que l’azoture de sodium - même à des concentrations élevées - avait un impact limité sur la morphologie mitochondriale dans le muscle ou l’intestin. Cependant, l’hypoderme présentait une fragmentation mitochondriale plus précoce que les témoins M9 (Figure 3). Il est important de noter que des concentrations élevées de tétramisole (100 mM) ont entraîné une fragmentation mitochondriale significative immédiatement après l’exposition dans tous les types de cellules. En comparaison, des concentrations moyennes (10 mM) ont entraîné une fragmentation plus rapide par rapport à un témoin M9. De faibles concentrations (1 mM) ont eu un impact limité sur la morphologie mitochondriale. Ces données suggèrent que l’utilisation de l’azoture de sodium peut être une option viable pour l’imagerie rapide des mitochondries, tandis que le tétramisole doit généralement être évité.
Comme prévu, les mitochondries de tous les tissus de C. elegans présentent une fragmentation au cours du processus de vieillissement naturel (Figure 4A). La fragmentation peut être visualisée comme des mitochondries se présentant sous la forme de structures plus tronquées et sphériques, qui sont radicalement différentes des mitochondries linéaires et tubulaires observées chez les jeunes animaux. Il est important de noter que l’intestin augmente dans les structures autofluorescentes sphériques à un âge plus avancé, il faut donc veiller à ne pas confondre l’autofluorescence avec les structures mitochondriales réelles. Étant donné qu’il peut y avoir une variabilité des changements dans la structure mitochondriale d’un vers à l’autre, il est important d’effectuer une quantification de la morphologie mitochondriale sur un échantillon de taille significative plutôt que de simplement imager quelques vers. Ici, mitoMAPR a été utilisé, qui permet une quantification automatisée de la morphologie mitochondriale à l’aide d’un ensemble diversifié de mesures, y compris les objets, les réseaux, les jonctions par réseau, les points de jonction, la longueur de l’objet, l’empreinte mitochondriale, la couverture mitochondriale et la surface de l’objet (tableau supplémentaire 1 et tableau supplémentaire 2). L’automatisation élimine les biais subjectifs de l’utilisateur. Ici, nous rapportons que la métrique de la longueur de l’objet est optimale pour mesurer quantitativement les changements dans la morphologie mitochondriale musculaire et intestinale au cours du vieillissement, et les mesures des points de jonction pour mesurer les changements dans la morphologie mitochondriale hypodermique au cours du vieillissement (Figure 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig01.jpg"> 
Figure 1 : Images de mitochondries dans tout le corps de C. elegans. L’imagerie mitochondriale a été réalisée pendant toute la durée du jour 5 chez des animaux adultes élevés sous EV à partir du stade L1 chez des animaux transgéniques avec une expression MLS ::GFP dans le muscle (A), l’intestin (B) et l’hypoderme (C). Barre d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig02.jpg"> 
Figure 2 : Comparaison de l’imagerie mitochondriale entre le microscope composé et le microscope confocal. L’imagerie mitochondriale a été réalisée chez des animaux adultes du jour 1 cultivés sous EV à partir du stade L1 chez des animaux transgéniques avec une expression de MLS ::GFP dans le muscle (A), l’intestin (B) et l’hypoderme (C). Barre d’échelle : 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig03.jpg"> 
Figure 3 : Évaluation de la fragmentation mitochondriale de différents tissus après traitement avec M9, azoture de sodium et tétramisole. L’imagerie mitochondriale a été réalisée chez des animaux adultes du jour 1 avec expression de MLS ::GFP dans le muscle, l’intestin et l’hypoderme. Les animaux ont été élevés sur EV à partir du stade L1. Les animaux ont été placés sur des lames contenant du M9, de l’azoture de sodium (1 mM, 10 mM et 100 mM) ou du tétramisole (1 mM, 10 mM et 100 mM) et l’imagerie a été réalisée immédiatement après la préparation de la lame (0 min) ou 15 min ou 30 min après la préparation de la lame. Des images représentatives sont montrées pour n &gt; 5 animaux par souche pour 2 répétitions biologiques. Barres d’échelle : 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig04.jpg"> 
Figure 4 : Imagerie mitochondriale de C. elegans au cours du vieillissement dans différents tissus et quantification de la morphologie mitochondriale à l’aide de MitoMAPR. (A) L’imagerie mitochondriale a été réalisée chez des animaux adultes aux jours 1, 5, 9, 13 et 15 de l’âge adulte avec expression de MLS ::GFP dans le muscle, l’intestin et l’hypoderme. Les animaux ont été élevés sur EV à partir du stade L1 et déplacés sur des plaques EV contenant du FUDR à partir du stade adulte du jour 1. Les images sont représentatives de n ≥ 5 animaux par souche pour ≥ 3 répétitions biologiques. Barre d’échelle : 5 μm. (B) La quantification de la longueur de l’objet des mitochondries musculaires et intestinales des vers les jours 1, 5, 9, 13 et 15, et la quantification des points de jonction des mitochondries hypodermiques des vers les jours 1, 5, 9, 13 et 15. Tous les points de données individuels combinés à la moyenne ± à l’écart-type. Les graphiques ont été tracés et analysés statistiquement à l’aide d’un test t d’étudiant. ns = non significatif, *p &lt; 0,03 ; **p &lt; 0,002 ; p &lt; 0,0002 ; p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Jours de vers</td>
			<td>Nombre de vers</td>
			<td>Volume de tampon (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Nombre recommandé de vers et volumes de mémoire tampon lors de la préparation des lames.
Figure supplémentaire 1 : Flux de travail de l’application d’une quantification d’image unique à l’aide de MitoMAPR et du traitement par lots pour plusieurs images. (A) Flux de travail de quantification de la morphologie mitochondriale à partir d’une seule image à l’aide de la macro MitoMAPR. (B) Projection Z d’un fichier d’image 3D brut à l’aide de Fidji (projection Max). (C) Recadrage de la région d’intérêt à partir de l’image projetée Z. (D) Images de Skeletor acquises à partir de la macro MitoMAPR. Barres d’échelle : 5 μm. (E) Flux de travail de quantification de la morphologie mitochondriale à partir de plusieurs images à l’aide du traitement par lots à l’aide de la macro MitoMAPR. (F) Capture d’écran de la macro de recadrage. (G) Capture d’écran d’un processus par lots pour la projection Z. (H) Capture d’écran de la fenêtre de confirmation de sélection de la macro de recadrage par lots. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Analyse quantitative des paramètres morphologiques mitochondriaux dans le tissu musculaire de C. elegans . Les mesures enregistrées incluent les objets, les réseaux, les jonctions par réseau, les points de jonction, la longueur de l’objet, l’empreinte mitochondriale, la surface de l’objet et la couverture mitochondriale, mesurées sur différents jours. Les données fournissent une base pour évaluer les changements de la morphologie mitochondriale avec le vieillissement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 2 : Effets des produits chimiques immobilisants sur la morphologie mitochondriale chez C. elegans. Les données comprennent des mesures telles que les objets, les réseaux, les jonctions par réseau, les points de jonction, la longueur de l’objet, l’empreinte mitochondriale, la surface de l’objet et la couverture mitochondriale à des concentrations et des points temporels variables après la préparation de l’échantillon avec un tampon M9 ou différentes concentrations de tétramisole et d’azoture de sodium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Imagerie et quantification de la morphologie mitochondriale chez C. elegans au cours du vieillissement

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

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