Imagerie par microscopie à épifluorescence time-lapse de Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus Phénotypes hétérogènes

Les recherches de notre laboratoire portent sur les raisons de l’échec des antibiotiques. En particulier, nous nous intéressons aux quelques cellules appelées persistantes dans les populations bactériennes qui sont censées être tuées par l’antibiotique, mais qui peuvent survivre au traitement antibiotique. Et on pense que ces persistants provoquent une rechute des infections après la fin du traitement antibiotique.

Nous nous intéressons donc à l’expression des gènes et au métabolisme de ces animaux persistants afin de mieux comprendre leurs stratégies de survie. Le défi actuel pour le domaine des récepteurs persistants est d’équilibrer le débit et la sensibilité d’une seule cellule. Nous devons faire correspondre la capacité d’une cellule unique à se diviser après le traitement, ce qui la qualifiera de persistante, avec un phénotype mesurable qui peut nous aider à comprendre le fonctionnement interne de la cellule.

Et nous devrons peut-être le faire pour des milliers de cellules afin de capturer ne serait-ce qu’un seul persistant. Notre protocole a été développé pour être facilement mis en œuvre par rapport aux méthodes imprécises de sandwich de gélose ou à la fabrication de dispositifs microfluidiques, qui peuvent être techniquement difficiles. Nous avons constaté que notre protocole produit une imagerie reproductible et stable dans le temps avec un minimum de matériaux, ce qui signifie qu’il est à la fois rentable et peu coûteux pour une collecte de données de qualité.

Nos recherches futures utiliseront une combinaison d’approches omiques et unicellulaires pour étudier comment les agents pathogènes réagissent et se rétablissent après un traitement avec différentes classes d’antibiotiques. Notre objectif ultime est de tirer parti de cette compréhension pour développer de nouvelles stratégies visant à améliorer le traitement des infections cliniques. Pour commencer, placez un couvercle stérile de 30 millimètres dans le fond de la base en acier inoxydable d’un plat interchangeable.

Enfilez doucement l’insert en polycarbonate dans la base, en vous assurant que la glissière de recouvrement forme la base de la chambre et scellez-la en place en comprimant le joint torique en silicone attaché. Placez un séparateur imprimé en 3D personnalisé contre la lamelle de 30 millimètres pour éviter la contamination croisée des cellules de modal. Préparez 1,5 % d’agarose dans un tube conique de 50 millilitres à l’aide du milieu de votre choix et remuez doucement pour mélanger.

Desserrez le capuchon du tube conique et placez-le dans un bécher en verre ou un support allant au micro-ondes. Passez le mélange d’agarose au micro-ondes à puissance élevée, en vous arrêtant toutes les trois à quatre secondes pour tourbillonner et mélanger pour éviter qu’il ne bouillonne. Au bout d’une minute, vérifiez s’il reste de l’agarose non fondue dans le mélange.

S’il est uniformément clair, laissez l’agarose refroidir brièvement à environ 60 degrés Celsius. Ajoutez les antibiotiques ou les matrices appropriés et remuez doucement pour mélanger, en évitant la formation de bulles. Pipetez deux millilitres d’agarose dans la chambre avec la lamelle de 30 millimètres.

Posez délicatement une gaine stérile de 25 millimètres sur l’agarose dans l’ouverture de la chambre supérieure. Laissez le tampon se solidifier pendant une à deux heures. Lorsque le tampon est solidifié, utilisez un marqueur permanent à pointe fine pour marquer l’emplacement et l’identité de chaque échantillon sur la lamelle de 25 millimètres.

Retournez la chambre de manière à ce que l’anneau de base en acier inoxydable soit tourné vers le haut et tenez soigneusement l’insert en polycarbonate en dessous tout en dévissant la base. Mettez la base en acier inoxydable de côté. Faites glisser le couvercle de 30 millimètres, glissez sur le tampon d’agarose et jetez-le.

Diluer les cultures de cellules de Pseudomonas aeruginosa ou de Staphylococcus aureus dans le PBS à une densité clairsemée adaptée à la visualisation de cellules uniques. Pipetez vigoureusement de haut en bas pour répartir uniformément les cellules. Repérez cinq microlitres de suspensions cellulaires diluées aux endroits marqués sur le tampon d’agarose.

Une fois les taches sèches, placez une nouvelle gaine stérile de 30 millimètres sur le tampon. Tenez ensuite l’insert en polycarbonate d’une main et enfilez lentement la base en acier inoxydable sur la lamelle. Une fois la chambre scellée, vérifiez si l’agarose entre en contact avec la surface de la lamelle de 30 millimètres.

À l’aide de l’extrémité émoussée de la pince à épiler, appuyez doucement contre la lamelle de 25 millimètres jusqu’à ce que l’agarose touche uniformément la lamelle de 30 millimètres sur sa surface. Pour commencer, préparez les contrôles environnementaux du microscope et de la chambre d’imagerie en réglant la température de l’incubateur supérieur de la scène et de l’incubateur à grande chambre à 37 degrés Celsius. Ensuite, allumez l’humidificateur à chambre.

Placez une préparation de tampon d’agarose dans l’incubateur supérieur de la scène et fermez la chambre pour permettre l’équilibre. Préparez le logiciel MetaMorph pour l’acquisition d’images en configurant l’algorithme de mise au point automatique intégré pour utiliser le canal de phase lors de l’acquisition multidimensionnelle. Dans l’onglet Étape, définissez plusieurs positions d’étape pour chaque échantillon, en ciblant les champs de vision avec une densité de cellule uniformément distribuée.

Ensuite, dans l’onglet Time-Lapse, configurez la durée et la fréquence d’acquisition des images. Dans l’onglet Longueurs d’onde, définissez les canaux souhaités pour l’acquisition et ajustez les temps d’exposition en fonction de l’intensité du signal de l’échantillon. Une fois que le tampon d’agarose s’est réchauffé dans la chambre, placez le couvercle d’humidification sur l’incubateur sur la scène.

Ensuite, sur le microscope, passez du mode de contraste de phase au mode de contraste interférentiel différentiel. Ajustez le condenseur et le diaphragme d’ouverture pour obtenir un éclairage Kohler approprié. Une fois les réglages terminés, repassez en mode de contraste de phase.

Naviguez jusqu’à chaque position de la scène, ajustez la mise au point et réinitialisez la position de la scène sur le nouveau plan focal. Cliquez sur le bouton Acquérir pour lancer l’acquisition multidimensionnelle. Après l’acquisition, pour compiler des images, ouvrez MetaMorph et utilisez l’application Review Multidimensional Data pour sélectionner les canaux ou les longueurs d’onde souhaités et inclure tous les points temporels pour chaque position de scène.

Cliquez sur Charger les images et enregistrez chaque compilation avec son nom de canal respectif en tant que fichier TIFF. Une imagerie en accéléré des cellules de Staphylococcus aureus a été réalisée, montrant une coloration à l’iodure de propidium au fur et à mesure que le traitement antibiotique progressait, ce qui indiquait des lésions membranaires. L’imagerie de Pseudomonas aeruginosa pendant le traitement antibiotique a montré que les cellules subissent la formation de sphéroplastes, la filamentation et la condensation cytoplasmique, accompagnées d’une coloration à l’iodure de propidium.

La préparation réussie du tampon d’agarose et les conditions d’imagerie ont permis d’observer Staphylococcus aureus se rétablir d’un traitement antibiotique et Pseudomonas aeruginosa se rétablir d’un traitement antibiotique pour former de grands amas dérivés de cellules uniques.