Quantification de la migration cellulaire tridimensionnelle à l’intérieur et dans les biomatériaux d’hydrogel granulaire

Notre recherche se concentre sur l’utilisation des propriétés uniques des hydrogels granulaires pour étudier le mouvement cellulaire et les fonctions de régénération des tissus. Il est important de modéliser la réponse cellulaire au microenvironnement pour comprendre les implications de l’impact translationnel. À mesure que l’utilisation d’échafaudages de ports 3D augmente, il est de plus en plus nécessaire de disposer de tests de migration 3D complets qui reproduisent mieux le comportement cellulaire dans un environnement de cicatrisation des plaies.

Nous avons développé deux pipelines tridimensionnels, du développement d’échafaudages à l’imagerie et à l’analyse, pour étudier le mouvement et la migration cellulaires in vitro. Grâce à ces deux nouveaux tests, nous avons acquis la capacité de suivre les cellules réactives à deux étapes distinctes de la cicatrisation des plaies : l’infiltration initiale de l’échafaudage à partir du tissu en vrac et le mouvement cellulaire une fois entourés d’un échafaudage complexe. Pour commencer, plaquez 120 000 cellules de fibroblastes dermiques humains par centimètre carré dans au moins six puits d’une plaque de 96 puits.

Après une nuit d’incubation, retirer le milieu des puits de la cellule à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette. Ajouter le colorant dans 20 microlitres de chaque état de gel dans les puits à l’aide d’une pipette à déplacement positif. À l’aide d’un accessoire de centrifugeuse à rotor rotatif réglé à 25 degrés Celsius, faites tourner la plaque à 100 g pendant 15 secondes avec une accélération et une décélération réglées sur 8 pour aplatir le gel.

Retournez la plaque à 180 degrés et tournez-la à nouveau pour assurer une répartition uniforme du gel au fond du puits. Pour photo-réticuler aseptiquement le gel, appliquez une lumière focalisée à 365 nanomètres pendant 30 secondes pour recuire l’échafaudage. Après avoir formé tous les échafaudages, ajoutez 200 microlitres de média dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Utilisez un microscope confocal pour imager les cellules et capturer leur comportement de migration. Pour l’analyse d’images, ouvrez le logiciel de conversion d’images Imaris pour les conversions par lots. Faites glisser et déposez des images de microscopie dans le logiciel de conversion et sélectionnez un dossier dans l’arène logicielle pour importer les fichiers.

Sélectionnez chaque fichier individuellement pour définir la taille du voxel. Appuyez sur Démarrer tout pour commencer la conversion. Ensuite, dans le logiciel Imaris Arena, sélectionnez une image de l’arène pour commencer le traitement.

Cliquez sur l’onglet Image Pros dans la barre d’outils principale. Maintenant, cliquez sur le menu déroulant du canal 1 et sélectionnez Soustraction d’arrière-plan. Appuyez sur OK pour revenir à la vue 3D.

Dans la petite barre d’outils, cliquez sur l’icône aux formes bleues arrondies intitulée Ajouter de nouvelles surfaces pour créer un onglet d’objets modifiables nommé Surfaces 1. Générez manuellement les paramètres de toutes les réplications à l’aide de la flèche bleue. Réglez les détails de la surface sur 0,7 micromètre et sélectionnez Soustraction d’arrière-plan, Contraste local.

Entrez la longueur moyenne de la cellule dans le diamètre de la plus grande sphère, qui tient dans la zone de l’objet. Pour le seuillage, déterminez l’histogramme d’intensité pour segmenter uniquement les cellules les plus brillantes. Activez la division des objets en contact, l’expansion de la région et définissez le diamètre des points d’amorçage pour qu’il corresponde au diamètre précédemment utilisé.

Pour enregistrer les paramètres de création pour l’analyse par lots, cliquez sur l’icône de baguette intitulée Création. Cliquez sur stocker les paramètres du lot, nommez le fichier, puis cliquez sur OK. Pour rassembler toutes les hauteurs de cellule, cliquez sur l’onglet Détaillé. Sélectionnez des valeurs spécifiques, puis Positionnez Z dans les menus déroulants.

Cliquez sur l’icône Enregistrer pour exporter toutes les positions Z et classifications dans un fichier XLS. Pour commencer, versez le PBS dans une boîte de Pétri sous le capot laminaire et pipetez des gouttelettes de 20 microlitres de la solution de milieu cellulaire sur le couvercle inversé de la boîte de Pétri. Remettez le couvercle sur le plat et incubez la plaque pour obtenir des sphéroïdes 3D suspendus cultivés en gouttelettes.

Pour mettre en place le PLOSMA, à l’aide d’une pipette à déplacement positif, ajoutez aseptiquement 15 microlitres de gel dans les puits d’une plaque transparente de 96 puits. À l’aide d’un accessoire de centrifugeuse à rotor rotatif à plaques, faites tourner la plaque à 1 000 g pendant 10 secondes pour aplatir le gel. Retournez la plaque à 180 degrés et tournez-la à nouveau pour assurer une répartition uniforme du gel.

Ensuite, appliquez une lumière focalisée à 365 nanomètres pendant 30 secondes pour recuire l’échafaudage et photo-réticuler le gel par le haut. Déplacez de manière aseptique la boîte de Pétri des gouttelettes suspendues dans le capot de culture tissulaire et retournez le couvercle. À l’aide d’une pipette de 20 microlitres, aspirez lentement une gouttelette jusqu’à ce que le sphéroïde pénètre dans la pointe de la pipette et éjectez la gouttelette sur l’échafaudage au centre du puits.

Incuber la plaque du puits à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour permettre aux sphéroïdes de se fixer à l’échafaudage. Après l’incubation, pipetez 15 microlitres supplémentaires de gel sur chaque sphéroïde. Centrifugez la plaque à 300 g pendant 15 secondes dans chaque direction pour assurer une distribution uniforme du gel.

Recuit la couche supérieure de gel pour l’utilisation de la lumière ultraviolette, comme démontré précédemment. Placez la plaque sous un microscope confocal et imagez les sphéroïdes après avoir sélectionné les plans Z le plus bas et le plus élevé. Après avoir importé les images dans le logiciel Imaris Arena, cliquez sur le menu déroulant du canal 1 et sélectionnez Soustraction d’arrière-plan.

Appuyez sur OK en bas du panneau. En mode 3D, appuyez sur Ajuster automatiquement tous les canaux dans la fenêtre contextuelle Réglage de l’affichage et apportez les corrections nécessaires. Dans la barre d’outils plus petite, cliquez sur l’icône Ajouter un nouveau cadre de référence pour créer un onglet intitulé Cadre de référence 1.

Déplacez l’origine au centre du sphéroïde dans les trois plans. Dans la même barre d’outils, cliquez sur l’icône avec des sphères orange pour ajouter de nouveaux points, créant ainsi un onglet nommé Spots 1, et appuyez sur le bouton flèche bleue pour continuer. Pour le seuillage, ajustez l’histogramme d’intensité pour segmenter uniquement les parties les plus lumineuses.

Utilisez le segment pour naviguer dans la pile d’images afin d’être précis. Appuyez trois fois sur la flèche bleue Suivant. Décochez la case Rendu sur le segment ou cliquez sur l’icône carrée jaune dans le panneau de configuration.

Cliquez sur l’onglet Statistiques. Dans les menus déroulants, sélectionnez des valeurs spécifiques et la distance par rapport au cadre de référence d’origine. Cliquez sur l’icône Enregistrer.

Pour enregistrer toutes les modifications et analyses, cliquez sur l’icône Enregistrer dans la barre d’outils principale. Cette méthode a été utilisée pour évaluer l’infiltration cellulaire à une interface tissulaire. La position médiane dans l’axe Z des cellules en migration a augmenté de manière significative, passant de zéro à 24 heures, ce qui indique un mouvement vertical notable des cellules.

Le changement de pli dans la migration cellulaire le long de l’axe Z a doublé après 24 heures. Les cellules ensemencées à l’aide de la méthode PLOSMA ont démontré une propagation et une migration significatives à partir du noyau sphéroïde après 24 heures. Les rendus tridimensionnels ont montré une expansion cellulaire étendue dans l’échafaudage PLOSMA après 24 heures, avec des projections visibles s’étendant vers l’extérieur.

Les images 3D traitées à l’aide de la fonction Spots ont révélé des positions cellulaires dispersées dans l’échafaudage, indiquant une migration généralisée. Les cellules ont parcouru une distance moyenne de plus de 200 micromètres avec des résultats cohérents sur tous les échantillons. Le changement de pli de hauteur Z des cellules dans l’échafaudage PLOSMA était d’environ 4, indiquant un mouvement ascendant substantiel.