Imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées

Nous étudions le mécanisme moléculaire et cellulaire de la transmission synaptique en utilisant la jonction neuromasculaire des larves de poisson-zèbre comme système modèle. Nous nous intéressons à la clarification de la modération régulatrice de la synapse en réponse à diverses conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole nous permet de visualiser une nouvelle transmission induite par le potentiel d’action dans la jonction neuromusculaire des larves de poisson-zèbre avec une sensibilité améliorée.

Nous pouvons surveiller la fonction synaptique provoquée par une stimulation modérée, ce qui n’a pas été testé auparavant. Ce protocole d’imagerie peut être réalisé sous un microscope à épifluorescence conventionnel et ne nécessite pas nécessairement un microscope confocal à balayage laser. En d’autres termes, cette méthode fournit une plate-forme rentable pour l’imagerie de la fonction neuromusculaire par rapport à d’autres configurations expérimentales.

Pour préparer 200 millilitres de solution extracellulaire, mélangez 6,4 millilitres de chlorure de sodium de 3,5 molaires, 0,4 millilitres de chlorure de potassium molaire, 1 millilitre d’une molaire HEPES, 0,4 millilitre de chlorure de calcium d’une molaire, 0,2 millilitre de chlorure de magnésium d’une molaire et 360 milligrammes de glucose. Ajoutez ensuite de l’eau ultrapure pour porter le volume total à 200 millilitres. Ajouter 20 microlitres de solution mère de D-tubocurarine de 15 millimolaires pour préparer 100 millilitres de solution extracellulaire avec 3 micromolaires de D-tubocurarine.

Pour préparer 25 millilitres de la solution extracellulaire contenant 0,02 % de tricaïne, ajoutez 0,5 millilitre de solution mère de tricaïne à 1 % à 25 millilitres de solution. À l’aide d’un extracteur de micro-pipette, tirez les capillaires en verre thêta jusqu’à ce que le diamètre de la pointe soit compris entre 3 et 10 micromètres. Remplissez la pipette avec la solution extracellulaire.

Insérez un mince fil de platine dans chaque ouverture du capillaire et tenez l’électrode de la pipette en verre thêta sur le support de pipette du micromanipulateur motorisé. Connectez ensuite l’extrémité arrière de chaque fil à l’isolateur de stimulus. Pour 25 millilitres de solution extracellulaire contenant 0,02 % de tricaïne dans une boîte de Pétri en verre, transférez une larve de poisson-zèbre dans la boîte de Pétri pour la dissection.

À l’aide de deux pinces fines, pelez la peau des larves. Utilisez la première pince pour maintenir les larves en place et pincez la peau du côté dorsal de la vessie natatoire avec l’autre pince. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, retirez la vessie natatoire, les organes internes et la tête.

À l’aide d’une pipette pasteure en verre avec une pointe polie au feu, transférez l’échantillon de poisson-zèbre disséqué dans la chambre d’imagerie. Fixez mécaniquement l’échantillon à l’aide d’un fil de nylon collé à un fil de platine en forme de C pour l’orienter à un angle approximativement parallèle à l’électrode de stimulation. Perfuser l’échantillon à l’aide d’un système d’écoulement par gravité à une vitesse de 1 millilitre par minute avec une solution extracellulaire contenant 3 micromolaires de D-tubocurarine.

Ensuite, insérez l’électrode de stimulation dans la moelle épinière. Positionnez soigneusement l’extrémité de l’électrode près des motoneurones de la moelle épinière, identifiés comme des neurones positifs au TagRFP situés sur la face ventrale de la moelle épinière. Avancez l’électrode à un angle oblique par rapport au segment adjacent à la position cible.

Pour commencer sur un ordinateur, sélectionnez la région d’imagerie en fonction de l’image en direct de la fluorescence TagRFP. Assurez-vous que la région sélectionnée comprend plusieurs boutons et exclut ceux situés près de la limite du segment de corps. Basculez l’unité de filtre de fluorescence GFP fluor fluorescence pour l’imagerie.

Ensuite, ajustez l’intensité de la source lumineuse pour obtenir une image lumineuse en mode time lapse de 1 hertz sans saturation. Entrez le temps d’exposition à 100 dans le champ Millisecondes d’exposition de la fenêtre du microgestionnaire. Configurez le logiciel d’acquisition d’images et le périphérique d’entrée-sortie numérique pour synchroniser l’acquisition d’images avec la stimulation électrique.

Ensuite, déterminez la fréquence de stimulation, le nombre de potentiels d’action et le délai entre le début de l’acquisition de l’image et l’administration de la stimulation dans le script Arduino. Sur la base de ces paramètres, calculez le nombre total d’images requis pour l’acquisition et entrez cette valeur dans le champ de comptage de la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle dans micromanager. Définissez un intervalle de 1 seconde dans le champ d’intervalle pour l’imagerie en accéléré de 1 hertz.

Pour la stimulation électrique, configurez l’isolateur de stimulus pour qu’il délivre des impulsions de tension constante de 1 milliseconde de 70 millivolts. Exécutez la commande du numériseur pour commencer l’acquisition de l’image. Surveillez le processus pour vérifier qu’il n’y a pas de dérive d’image inacceptable et que le fluor et les réponses sont observables.

Modifiez l’intensité de la stimulation, comme la fréquence en nombre d’impulsions, ou ajustez la température en fonction de l’objectif de l’expérience. Enregistrez les images time-lapse sous forme de pile de séries chronologiques TIFF. Des réponses fluorées robustes ont été observées lors d’une stimulation électrique à haute fréquence avec des changements de fluorescence indiquant une exocytose pendant la stimulation et une décomposition ultérieure, reflétant l’endocytose et la réacidification des vésicules synaptiques.

Les constantes de temps de décroissance de la fluorescence variaient en fonction du stimulus, de l’intensité et de la température, avec des potentiels d’action de 20 hertz 25 à 16,6 secondes, des potentiels d’action de 20 hertz à 100 à 56,8 secondes et des potentiels d’action de 50 hertz à 62,7 secondes.