Name: Imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de Danio rerio disséquées. Cette méthode économique permet d'étudier la transmission synaptique avec une sensibilité améliorée.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+presynaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vacuolar-type+h%2B+atpase-mediated+proton+influx+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles.</a> J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).</li>
<li>Egashira, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+ph+dynamics+in+gabaergic+synaptic+vesicles+illuminates+the+mechanism+and+kinetics+of+gaba+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).</li>
<li>Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snare+function+analyzed+in+synaptobrevin%2Fvamp+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice.</a> Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).</li>
<li>Takamori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+anatomy+of+a+trafficking+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular anatomy of a trafficking organelle.</a> Cell. 127 (4), 831-846 (2006).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).</li>
<li>Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+regulates+the+kinetics+of+synaptic+vesicle+endocytosis+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons.</a> Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).</li>
<li>Voglmaier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endocytic+pathways+control+the+rate+and+extent+of+synaptic+vesicle+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling.</a> Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).</li>
<li>Balaji, J., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vesicle+imaging+reveals+that+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+are+coupled+by+a+single+stochastic+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).</li>
<li>Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+the+vesicular+gaba+transporter+to+functional+vesicle+pools+by+an+atypical+dileucine-like+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif.</a> J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+and+asynchronous+modes+of+synaptic+transmission+utilize+different+calcium+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources.</a> Elife. 2, e01206(2013).</li>
<li>Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatigue+in+rapsyn-deficient+zebrafish+reflects+defective+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release.</a> J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).</li>
<li>Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+synaptic+vesicle+release+at+neuromuscular+synapses+of+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li>
<li>Tabares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+synaptic+function+at+the+neuromuscular+junction+of+a+mouse+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).</li>
<li>Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+luminance+and+contrast+by+linear+and+nonlinear+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina.</a> Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).</li>
<li>Almeida, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+induces+axonal+hotspots+of+synaptic+vesicle+fusion+that+promote+sheath+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth.</a> Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).</li>
<li>Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+dynamics+of+synaptic+vesicle+trafficking+and+fusion+at+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone.</a> eLife. 5, e13245(2016).</li>
<li>Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+newly+released+synaptic+vesicle+proteins+at+ribbon+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones.</a> iScience. 17, 10-23 (2019).</li>
<li>Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+dynamics+of+single+fused+synaptic+vesicle+proteins+from+a+single+ribbon+active+zone+in+zebrafish+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).</li>
<li>Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuromuscular+junction+research+prompted+by+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model.</a> Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).</li>
<li>Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+recycling+synaptic+vesicles+constitute+readily+releasable+vesicles+in+intact+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).</li>
<li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+synaptic+plasticity+in+acute+hippocampal+slices+maintained+in+a+small-volume+recycling-%2C+perfusion-%2C+and+submersion-type+chamber+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system.</a> J Vis Exp. (131), e55936(2018).</li>
<li>Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+axonal+outgrowth+of+identified+motoneurons+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).</li>
<li>Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Brehm, P., Wen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+neuromuscular+junction%3A+The+power+of+n%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Zebrafish neuromuscular junction: The power of n.</a> Neurosci Lett. 713, 134503(2019).</li>
<li>Ben Fredj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Mandal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+mitochondrial+transport+is+essential+for+organelle+distribution+and+health+in+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons.</a> J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).</li>
<li>Wong, H. C., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+indicators+for+in+vivo+quantification+of+spontaneous+or+evoked+motor+neuron+presynaptic+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+recycling+in+the+synaptic+bouton%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton.</a> Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).</li>
<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensors+and+regulators+of+intracellular+ph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensors and regulators of intracellular ph.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Objectif à immersion dans l’eau 40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>système de perfusion par gravité 4ch</td><td>ALA</td><td>VCPlus-4G</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 5x</td><td>Olympus</td><td>NPLN5X</td><td></td></tr><tr><td>Custum fabriqué Chambre d’imagerie</td><td>Physiotech</td><td>custum fabriqué Une</td><td>plaque acrylique noire (10,7 cm de diamètre, 3 mm d’épaisseur) avec un puits (1 cm de diamètre en bas, 1,5 cm de diamètre en haut) contenant environ 0,5 ml de perfusat.</td></tr><tr><td>Dispositif d’E/S numériques</td><td>Arduino</td><td>Uno Rev3</td><td></td></tr><tr><td>D-Tubocurarine dichloride pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>93750</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office Professional Plus 2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji / imageJ</td><td>https://imagej.net/</td> <td>imageJ 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>AsOne</td><td>7-562-05 (Dumont #5)</td><td></td></tr><tr><td>Verre Pasteur pipette</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td>La pointe doit être taillée et polie au feu jusqu’à ce que le diamètre final soit de 1,5&ndash ; 2 millimètres.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre</td><td>AsOne</td><td>1-4564-06</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Ver. 6.37</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage de solution en ligne</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Système d’éclairage LED</td><td>X-cyte</td><td>XYLIS</td><td></td></tr><tr><td>Methylen blue</td><td>Wako</td><td>133-06962</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>Ver. 2.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Mini pince magnétique pour tube de perfusion</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1553</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur motorisé</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’échantillonnage mobile motorisée</td><td>Scientifica</td><td>MMSP</td><td></td></tr><tr><td>Porte-pipette</td><td>Narishige</td><td>H-13</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipette</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Fil de platine (&phi ; 0,1 mm)</td> <td>Nilaco</td><td>PT-351165</td><td></td></tr><tr><td>Fil de platine (&phi ; 0,5 mm)</td><td>Niaco</td><td>PT-351381</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>AsOne</td><td>8-3086-02 (Feather #11)</td><td></td></tr><tr><td>Caméra scientifique cMOS</td><td>Thorlabs</td><td>CC215MU</td><td></td></tr><tr><td>Sel de mer</td><td>NAPQO</td><td>Instant Ocean</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Isolateur de stimulus</td><td>AMPI</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’aspiration</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-3, 64-1406</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre Thêta</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaïne (MS-222)</td><td>TCI</td><td>T0941</td><td></td></tr><tr><td>Microscope droit</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Si l’échantillon disséqué est préparé sans lésions tissulaires graves et que l’électrode de stimulation est correctement insérée dans la moelle épinière, une réponse pHluorin robuste peut être déclenchée par une stimulation électrique à haute fréquence (Figure 4D,E). La fluorescence de base avant le stimulus était probablement due à la sonde présente à la surface de la présynapse. L’augmentation de la fluorescence pendant la stimulation reflète la libération exocytotique de ...

Imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Nous étudions le mécanisme moléculaire et cellulaire de la transmission synaptique en utilisant la jonction neuromasculaire des larves de poisson-zèbre comme système modèle. Nous nous intéressons à la clarification de la modération régulatrice de la synapse en réponse à diverses conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole nous permet de visualiser une nouvelle transmission induite par le potentiel d’action dans la jonction neuromusculaire des larves de poisson-zèbre avec une sensibilité améliorée.Nous pouvons surveiller la fonction synaptique provoquée par une stimulation modérée, ce qui n’a pas été testé auparavant. Ce protocole d’imagerie peut être réalisé sous un microscope à épifluorescence conventionnel et ne nécessite pas nécessairement un microscope confocal à balayage laser. En d’autres termes, cette méthode fournit une plate-forme rentable pour l’imagerie de la fonction neuromusculaire par rapport à d’autres configurations expérimentales.Pour préparer 200 millilitres de solution extracellulaire, mélangez 6,4 millilitres de chlorure de sodium de 3,5 molaires, 0,4 millilitres de chlorure de potassium molaire, 1 millilitre d’une molaire HEPES, 0,4 millilitre de chlorure de calcium d’une molaire, 0,2 millilitre de chlorure de magnésium d’une molaire et 360 milligrammes de glucose. Ajoutez ensuite de l’eau ultrapure pour porter le volume total à 200 millilitres. Ajouter 20 microlitres de solution mère de D-tubocurarine de 15 millimolaires pour préparer 100 millilitres de solution extracellulaire avec 3 micromolaires de D-tubocurarine.Pour préparer 25 millilitres de la solution extracellulaire contenant 0,02 % de tricaïne, ajoutez 0,5 millilitre de solution mère de tricaïne à 1 % à 25 millilitres de solution. À l’aide d’un extracteur de micro-pipette, tirez les capillaires en verre thêta jusqu’à ce que le diamètre de la pointe soit compris entre 3 et 10 micromètres. Remplissez la pipette avec la solution extracellulaire.Insérez un mince fil de platine dans chaque ouverture du capillaire et tenez l’électrode de la pipette en verre thêta sur le support de pipette du micromanipulateur motorisé. Connectez ensuite l’extrémité arrière de chaque fil à l’isolateur de stimulus. Pour 25 millilitres de solution extracellulaire contenant 0,02 % de tricaïne dans une boîte de Pétri en verre, transférez une larve de poisson-zèbre dans la boîte de Pétri pour la dissection.À l’aide de deux pinces fines, pelez la peau des larves. Utilisez la première pince pour maintenir les larves en place et pincez la peau du côté dorsal de la vessie natatoire avec l’autre pince. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, retirez la vessie natatoire, les organes internes et la tête.À l’aide d’une pipette pasteure en verre avec une pointe polie au feu, transférez l’échantillon de poisson-zèbre disséqué dans la chambre d’imagerie. Fixez mécaniquement l’échantillon à l’aide d’un fil de nylon collé à un fil de platine en forme de C pour l’orienter à un angle approximativement parallèle à l’électrode de stimulation. Perfuser l’échantillon à l’aide d’un système d’écoulement par gravité à une vitesse de 1 millilitre par minute avec une solution extracellulaire contenant 3 micromolaires de D-tubocurarine.Ensuite, insérez l’électrode de stimulation dans la moelle épinière. Positionnez soigneusement l’extrémité de l’électrode près des motoneurones de la moelle épinière, identifiés comme des neurones positifs au TagRFP situés sur la face ventrale de la moelle épinière. Avancez l’électrode à un angle oblique par rapport au segment adjacent à la position cible.Pour commencer sur un ordinateur, sélectionnez la région d’imagerie en fonction de l’image en direct de la fluorescence TagRFP. Assurez-vous que la région sélectionnée comprend plusieurs boutons et exclut ceux situés près de la limite du segment de corps. Basculez l’unité de filtre de fluorescence GFP fluor fluorescence pour l’imagerie.Ensuite, ajustez l’intensité de la source lumineuse pour obtenir une image lumineuse en mode time lapse de 1 hertz sans saturation. Entrez le temps d’exposition à 100 dans le champ Millisecondes d’exposition de la fenêtre du microgestionnaire. Configurez le logiciel d’acquisition d’images et le périphérique d’entrée-sortie numérique pour synchroniser l’acquisition d’images avec la stimulation électrique.Ensuite, déterminez la fréquence de stimulation, le nombre de potentiels d’action et le délai entre le début de l’acquisition de l’image et l’administration de la stimulation dans le script Arduino. Sur la base de ces paramètres, calculez le nombre total d’images requis pour l’acquisition et entrez cette valeur dans le champ de comptage de la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle dans micromanager. Définissez un intervalle de 1 seconde dans le champ d’intervalle pour l’imagerie en accéléré de 1 hertz.Pour la stimulation électrique, configurez l’isolateur de stimulus pour qu’il délivre des impulsions de tension constante de 1 milliseconde de 70 millivolts. Exécutez la commande du numériseur pour commencer l’acquisition de l’image. Surveillez le processus pour vérifier qu’il n’y a pas de dérive d’image inacceptable et que le fluor et les réponses sont observables.Modifiez l’intensité de la stimulation, comme la fréquence en nombre d’impulsions, ou ajustez la température en fonction de l’objectif de l’expérience. Enregistrez les images time-lapse sous forme de pile de séries chronologiques TIFF. Des réponses fluorées robustes ont été observées lors d’une stimulation électrique à haute fréquence avec des changements de fluorescence indiquant une exocytose pendant la stimulation et une décomposition ultérieure, reflétant l’endocytose et la réacidification des vésicules synaptiques.Les constantes de temps de décroissance de la fluorescence variaient en fonction du stimulus, de l’intensité et de la température, avec des potentiels d’action de 20 hertz 25 à 16,6 secondes, des potentiels d’action de 20 hertz à 100 à 56,8 secondes et des potentiels d’action de 50 hertz à 62,7 secondes.

live-imaging-synaptic-vesicle-recycling-neuromuscular-junction

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

Ce protocole traite de la dissection en direct...

Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire

Les larves de poisson zèbre constituent le système de premier vertébré modèle pour permettre l'enregistrement simultané de patch-clamp à partir d'un motoneurone spinal et de cibler des muscles squelettiques. Cette vidéo illustre les méthodes microscopiques utilisées pour identifier un CAP segmentaire motoneurone et les cellules musculaires cibles ainsi que les méthodologies pour l'enregistrement de chaque type de cellule.

Jumelés Recordings Patch Clamp du motoneurone et de muscle ciblé squelettiques chez le poisson zèbre

Dissection et l&#39;imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire

Un dispositif simple microfluidique a été développé pour effectuer anesthésie...

Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

Cette vidéo présente un protocole permettant d’étudier le recyclage des vésicules synaptiques aux jonctions neuromusculaires chez des larves de drosophile exprimant la channelrhodopsine à l’aide d’un colorant fluorescent. La lumière bleue active les channelrhodopsines, provoquant un afflux de calcium et une exocytose des vésicules synaptiques. Le colorant s’intègre dans les membranes neuronales et est internalisé pendant l’endocytose, ce qui entraîne une fluorescence accrue. Une stimulation...

Analyse du recyclage des vésicules synaptiques et de l’absorption de colorant fluorescent chez les larves de drosophile

Source : Schramm, P. et al. Imagerie in vivo du tissu cérébral entièrement actif chez les larves et les juvéniles de poisson-zèbre éveillés par ablation du crâne et de la peau. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo démontre l’imagerie in vivo des neurones cérébelleux chez les larves de poisson-zèbre transgénique, qui expriment des protéines fluorescentes dans les neurones de Purkinje. Le processus consiste à anesthésier les larves, à les immobiliser dans de l’agarose et à retirer soigneusement la peau...

Imagerie in vivo du cerveau d’une larve de poisson-zèbre pour visualiser les neurones cérébelleux

Source : Lukasz, D., et al. Imagerie calcique in vivo des cellules ciliées de la ligne latérale chez les larves de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre l’imagerie en direct de l’afflux de calcium dans les cellules ciliées de la ligne latérale d’une larve de poisson-zèbre transgénique paralysée à l’aide d’un microscope confocal. La stimulation mécanique des faisceaux de cheveux par des impulsions fluides induit l’entrée du calcium par les canaux de mécanotransduction et les...

Imagerie de la dynamique calcique dans les cellules ciliées de la ligne latérale des larves de poisson-zèbre

Le poisson-zèbre est un système de modèle qui possède de nombreuses fonctionnalités utiles y compris la clarté optique, rapide développement externe et, d’une importance particulière pour le domaine de l’ouïe et l’équilibre, extérieurement situé des cellules ciliées sensorielles. Cet article décrit comment transgénique zebrafish permet de doser la mécanosensibilité cellulaire-cheveux et la fonction présynaptique dans sa totalité.

En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

Nous faisons la démonstration d’une méthode qui tire parti de la microscopie confocale à balayage rapide pour effectuer une imagerie en direct des cellules microgliales dans le tectum optique du poisson-zèbre en développement, permettant ainsi l’analyse de la dynamique de ces cellules in vivo.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour examiner l’activité neuronale dans les régions cérébrales du poisson-zèbre transgénique qui expriment des indicateurs calciques GCaMP à l’aide de la microscopie confocale.

In vivo Imagerie confocale par fluorescence de l’activité neuronale induite par la stimulation sensorielle chez des larves de poisson-zèbre partiellement restreintes

Découvrez l'imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de Danio rerio disséquées. Cette méthode économique permet d'étudier la transmission synaptique avec une sensibilité améliorée.

Imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées

Explorer plus de vidéos