Préparation de plaquettes humaines lavées pour des études quantitatives de flux métaboliques
10 janvier 2025
Le métabolisme plaquettaire est intéressant, en particulier en ce qui concerne le rôle de l’hyperactivité et de l’hypoactivité plaquettaires dans les saignements et les troubles thrombotiques. L’isolement des plaquettes du plasma est nécessaire pour certains tests métaboliques ; Voici une méthode d’isolement des métabolites intracellulaires à partir de plaquettes lavées.
J’ai étudié l’impact de l’exposition aiguë aux œstrogènes sur le métabolisme central du carbone plaquettaire et les plaquettes au repos et activées par la thrombine. Nous tentons de déterminer si l’exposition aiguë aux œstrogènes sur les plaquettes contribue à l’augmentation du risque thrombotique induite par l’utilisation de contraceptifs oraux. La recherche sur la santé des femmes est largement sous-financée.
Ce projet s’inscrivait dans le cadre d’un appel plus vaste des NIH visant à combler les lacunes dans les connaissances sur la santé des femmes. Bien que les contraceptifs soient disponibles depuis plus de 50 ans, nous ne connaissons toujours pas le mécanisme exact qui entraîne un risque thrombotique plus élevé. Variabilité biologique.
Les techniques traditionnelles de culture cellulaire ne s’appliquent pas aux plaquettes, ce qui signifie que les plaquettes proviennent de donneurs de génotypes différents. Des échantillons de grande taille sont nécessaires, ce qui souligne la nécessité d’une procédure d’isolement plaquettaire reproductible. Les protocoles de lavage des plaquettes existants sont rédigés pour des experts dans le domaine de la biologie des plaquettes.
Il y a un certain nombre de défis uniques associés au travail sur les plaquettes que mon protocole met en évidence pour le chercheur novice sur les plaquettes. Pour commencer, préchauffez le bain-marie à 37 degrés Celsius et placez-y le tampon Tyrode modifié contenant du glucose. Combinez tout le sang prélevé sur tous les vacutainers dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres.
À l’aide d’une pointe de pipette coupée en biseau, prélevez un volume d’échantillon approprié pour effectuer un comptage cellulaire. Aspirez soigneusement avec une pipette de transfert à alésage étroit pour éliminer les bulles générées. Laissez ensuite reposer le sang dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes.
Pour éviter l’activation pendant la centrifugation, ajoutez de la prostaglandine I2 et de l’apyrase au sang total et retournez le tube une fois pour mélanger l’échantillon. Ensuite, centrifugez le sang entier à 250 G pendant 15 minutes sans pause à 37 degrés Celsius. Récupérez le PRP, qui apparaît comme la couche jaune supérieure au-dessus de la couche chamoisique et la couche de sang rouge dans un nouveau tube conique incliné de 50 millilitres le long de la paroi.
Laissez reposer le PRP pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, mélangez le PRP avec 500 nanomolaires de prostaglandine I2 et 0,02 unité par millilitre d’apyrase. Centrifugez le mélange à 1 000 G pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius sans accélération ni pause.
À l’aide d’une pipette de transfert en plastique de gros calibre, aspirez le surnageant pour le volume en vrac, puis utilisez une pipette d’un millilitre avec une pointe non coupée pour aspirer le liquide restant près de la pastille. Ajoutez ensuite de la prostaglandine I2 et du tampon Tyrode contenant de l’apyrase à la pastille, sur le côté du tube conique. À l’aide d’une pointe coupée en biseau et d’une pointe de pipette d’un millilitre, remettez doucement la pastille en suspension à plusieurs reprises.
Une fois la pastille remise en suspension, utilisez une pipette de transfert à large diamètre pour la transférer dans un nouveau tube conique, en laissant derrière elle les globules rouges ou les cellules visiblement agglomérées. Prélevez ensuite un échantillon pour la cytométrie en flux à l’aide d’une pointe de pipette coupée en biseau. Incuber le reste des plaquettes pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre aux inhibiteurs de s’estomper.
Après l’incubation, mélangez délicatement l’échantillon à l’aide d’une pipette de gros calibre et aliquotez les échantillons pour la cytométrie en flux. La récupération moyenne des plaquettes du sang total était d’environ 52 %, la contamination des globules blancs restant inférieure à 0,1 % après le processus de lavage. L’exposition à la sélectine P était faible tout au long du processus de lavage, mais a augmenté de manière significative après le traitement à la thrombine.
Les niveaux de fibrinogène lié ont d’abord augmenté après le premier spin de 1 000 G, mais sont tombés en dessous de 5 % après le deuxième spin, augmentant à nouveau de manière significative après le traitement par thrombine. Les plaquettes ont été contrôlées avec succès pour la taille, les débardeurs et la positivité CD42a avant de mesurer les marqueurs d’activation. Le traitement à la thrombine a entraîné une augmentation significative de l’expression de la P-sélectine et du fibrinogène par rapport au contrôle.
Pour commencer, obtenez les plaquettes lavées à partir d’échantillons de sang humain. Après avoir pré-refroidi la microcentrifugeuse à zéro degré Celsius, récupérez la suspension plaquettaire dans une solution saline normale partiellement congelée dans un rapport de 1:6. Centrifugez le mélange à 16 000 G pendant 10 minutes à zéro degré Celsius.
Aspirez le surnageant dans un tube de microcentrifugation séparé. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de méthanol :eau pré-refroidi à moins 20 degrés Celsius à la pastille trempée et agitez vigoureusement pendant une minute. Congelez l’échantillon dans de l’azote liquide et décongelez-le à zéro degré Celsius.
Centrifugez à nouveau la suspension à 16 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis recueillez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Après avoir séché le surnageant pendant la nuit, remettez l’extrait sec en suspension dans 150 microlitres d’eau de qualité LC/MS et mélangez pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Vortex brièvement et transférez l’extrait dans un tube de microcentrifugation de 0,22 micromètre pour éliminer les débris cellulaires.
Centrifugez l’échantillon pendant cinq minutes à 16 000 G et quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, pipetez 50 microlitres d’eau supplémentaires sur le filtre et centrifugez à nouveau pendant cinq minutes à 16 000 G et quatre degrés Celsius. Enfin, prélevez le filtrat pour analyse.
La production de lactate était positive dans tous les échantillons de donneurs, tandis que le glucose et l’acétate étaient constamment consommés, la thrombine augmentant ces flux.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude examine l'impact d'une exposition aiguë aux œstrogènes sur le métabolisme central du carbone dans les plaquettes, en se concentrant sur la manière dont cela pourrait contribuer au risque accru de thrombose associé à l'utilisation de contraceptifs oraux. Elle décrit une méthode permettant d'isoler efficacement les métabolites intracellulaires de plaquettes lavées, essentielle pour les dosages métaboliques.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Métabolisme des plaquettes
- Risques thrombotiques associés aux œstrogènes et aux contraceptifs oraux
- Recherche sur la santé des femmes
Contexte
- L'hyperactivité et l'hyporéactivité plaquettaires sont liées aux troubles hémorragiques et thrombotiques.
- Domaine de recherche traditionnellement sous-financé dans la santé des femmes.
- Nécessité de protocoles reproductibles pour l'isolement des plaquettes en raison de la variabilité biologique entre les donneurs.
Méthodes utilisées
- Isolation des métabolites intracellulaires à partir de plaquettes lavées.
- Des échantillons de sang humain ont été utilisés pour réaliser des dosages métaboliques.
- Utilisation de la cytométrie en flux et d'autres techniques expérimentales pour l'analyse.
Résultats principaux
- Isolation réussie de plaquettes avec un rendement moyen de 52 % et une contamination minimale.
- Le traitement par la thrombine a significativement augmenté l'expression de la P-sélectine et du fibrinogène sur les plaquettes.
- Des modifications des taux de lactate, de glucose et d'acétate observées au cours des dosages.
Conclusions
- L'étude démontre un protocole fiable pour l'isolement des plaquettes et l'analyse métabolique.
- Les résultats contribuent à la compréhension des mécanismes sous-jacents aux risques thrombotiques associés à l'œstrogène dans la santé des femmes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les études quantitatives des flux métaboliques dans les plaquettes humaines nécessitent des protocoles d'isolement hautement standardisés afin d'assurer la reproductibilité et de minimiser la variabilité biologique. Cette méthode permet un contrôle précis du nombre de plaquettes et de leur environnement métabolique, soutenant ainsi une validation robuste des cibles et une réduction des risques mécanistiques en phase de découverte précoce. Une préparation fiable des plaquettes est fondamentale pour la recherche translationnelle sur les troubles métaboliques et thrombotiques, influant directement sur les décisions stratégiques dans les programmes cardiovasculaires et de santé des femmes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse de voies métaboliques plaquettaires pertinentes pour les mécanismes des maladies.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles en isolant des plaquettes quiescentes et sensibles aux stimuli.
- Facilite une évaluation prédictive fiable du phénotype métabolique à travers des échantillons de donneurs.
Développement de tests et criblage
- Permet d'obtenir des préparations de plaquettes peu activées, reproductibles, destinées à des dosages métaboliques en aval.
- Standardise l'entrée d'échantillon pour l'analyse quantitative des flux métaboliques.
- Permet une évaluation fiable des effets de composés sur le métabolisme et l'activation plaquettaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Associe les paramètres métaboliques à des phénotypes plaquettaires pertinents pour la maladie, afin de développer des biomarqueurs translationnels.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en minimisant la variabilité liée aux donneurs et aux procédures.
- Permet la progression ajustée au risque des cibles métaboliques dans les programmes de recherche sur les thromboses et les troubles hémorragiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'isolement des plaquettes s'intègre dans la continuité découverte-préclinique, permettant des études métaboliques fondées sur des hypothèses et soutenant l'identification de candidats thérapeutiques dans la recherche sur les maladies cardiovasculaires et métaboliques.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses concernant les réponses métaboliques des plaquettes à des stimuli ou des composés.
- Tri : Fournit des échantillons de plaquettes standardisés et prêts à être utilisés dans des tests pour des mesures métaboliques reproductibles.
- Analytique : Fournit des résultats quantitatifs tels que la production de lactate et la consommation de substrat pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les phénotypes métaboliques in vitro et les facteurs de risque cliniques ainsi que les stratégies de biomarqueurs.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un protocole réutilisable pour diverses études métaboliques et d'activation à travers différents programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les études métaboliques sur les plaquettes et réduit l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Fournit des préparations de plaquettes standardisées, évolutives et reproductibles pour des flux de travail à haut débit.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en permettant un phénotypage métabolique robuste et une priorisation des cibles.
- Impact sur le portefeuille : Favorise un développement ajusté au risque et une comparabilité inter-programmes dans la recherche métabolique et thrombotique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biologie plaquettaire et en manipulation afin de minimiser les artefacts d'activation.
- Exige un accès à la cytométrie en flux, à la centrifugation et à une infrastructure analytique de type LC/MS.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles d'isolement et de dosage pour assurer la reproductibilité.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les populations de donneurs ou les modèles de maladie.
- La sensibilité au cisaillement des plaquettes et le risque d'activation imposent des limites pratiques en termes de débit et de manipulation des échantillons.
