Évaluation de la phagocytose microgliale des débris de myéline in vitro sous stimulation magnétique répétée

[Instructeur] Le champ de notre étude se concentre sur la recherche en neuro-réhabilitation et en thérapie de simulation magnétique. Ce protocole peut fournir de nouvelles idées pour la stimulation magnétique en explorant comment elle affecte une fonction claire. À l’avenir, nous nous concentrerons sur la neuro-réhabilitation et la thérapie de stimulation magnétique.

[Instructeur] Pour commencer, procurez-vous une tête décapitée d’un rat femelle. Disséquez la tête sur de la glace. À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez le crâne en deux pour exposer complètement le cerveau et faciliter son retrait complet. Utilisez des ciseaux et des pinces pour exciser méticuleusement et aseptiquement les membranes, le cervelet et l’hippocampe. Nettoyez le cerveau trois fois avec du PBS pour éliminer tout résidu de sang ou de tissu. Transférez le cerveau nettoyé dans 10 millilitres de solution de saccharose stérile à 0,32 molaire. À l’aide d’une paire de ciseaux microchirurgicaux, coupez le tissu cérébral en morceaux pour obtenir un mélange de tissu cérébral et de saccharose. Ensuite, transférez le mélange de tissu cérébral et de saccharose dans un homogénéisateur stérile de 50 millilitres. Ajouter 30 millilitres de solution de saccharose stérile à 0,32 molaire. Utilisez un homogénéisateur en verre de 50 millilitres pour broyer le mouchoir pendant deux minutes. Pour obtenir un homogénat de tissu cérébral lisse. Diluez l’homogénat de tissu cérébral à 90 millilitres avec une solution de saccharose stérile à 0,32 molaire et mélangez soigneusement. Ajoutez 20 millilitres de solution de saccharose stérile de 0,83 molaire dans six tubes d’ultracentrifugation stériles en polypropylène à paroi mince. Ensuite, versez lentement 15 millilitres du mélange cérébral dans la partie supérieure des tubes. Nivelez les volumes avec une solution de saccharose stérile à 0,32 molaire. Pour collecter les débris de myéline brute, il faut d’abord pré-refroidir et ultra-centrifuger rotor à quatre degrés Celsius. Centrifugez l’échantillon à 75 000 G pendant 45 minutes, puis collectez les débris de myéline à l’interface entre les deux densités de saccharose à l’aide d’une pipette de pâturage stérile. Pour la première séparation isotonique et la purification, transférez la solution de débris de myéline collectée dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Ajustez le volume à 35 millilitres avec du PBS stérile pré-refroidi et transférez-le dans un nouveau tube d’homogénéisation. Après l’homogénéisation pendant trois minutes, répartissez uniformément l’homogénat de débris de myéline dans six tubes à ultracentrifuger stériles en polypropylène à paroi mince de 38,5 millilitres. Complétez le volume avec du PBS stérile, puis centrifugez. Pour la deuxième séparation isotonique et la purification, remettre en suspension la pastille blanche solide dans 10 millilitres de PBS stérile pré-refroidi pour obtenir une suspension de débris de myéline. Répartissez la suspension dans des tubes d’ultracentrifugation comme précédemment, puis centrifugez. Après la centrifugation, jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille blanche solide dans six millilitres de PBS stérile. Divisez la suspension de débris de myéline dans six tubes de centrifugation de 1,5 et centrifugez à nouveau. Enfin, remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de PBS stérile pré-refroidi après avoir jeté le surnageant. Décongelez les débris de myéline requis à quatre degrés Celsius, ou dans de l’eau glacée, et centrifugez comme précédemment pendant 10 minutes. Remettez en suspension les débris de myéline dans 200 microlitres de solution CFSE de 50 micromolaires. Incuber la suspension à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes, puis centrifuger à nouveau. Jetez le surnageant, puis lavez les échantillons trois fois avec 500 microlitres de PBS stérile. Remettre en suspension les débris de myéline dans 100 microlitres de PBS stérile pré-refroidi pour obtenir une suspension de débris de myéline marqués par fluorescence. Conservez l’échantillon à -80 degrés Celsius jusqu’à nouvel ordre. Pour une stimulation magnétique répétée in vitro, réglez la fréquence de traitement sur 20 hertz, l’intensité du traitement sur 1 % de l’intensité de sortie maximale et le temps de stimulation sur cinq secondes. Incluez une période de repos de 20 secondes et administrez 600 impulsions sur une seule durée de traitement de 2,5 minutes. Après avoir prédéterminé les paramètres de stimulation magnétique, fixez la direction de la bobine perpendiculairement au sol et orientez-la vers le haut. Stérilisez la bobine de stimulation magnétique avec de l’alcool pour éviter la contamination cellulaire. Après avoir ajouté 50 micromolaires de CFSE, plaquez 1 000 cellules BV-2 dans des plaques à 24 puits pendant la nuit, puis aspirez l’ancien milieu à l’aide d’une pipette et ajoutez immédiatement un milieu frais sans sérum. Changez le milieu pour un milieu sans sérum et traitez les cellules avec un microgramme par millilitre de lipopolysaccharide pendant 12 heures. Après 12 heures d’intervention de lipopolysaccharides, ajoutez 100 microgrammes par millilitre de débris de myéline dans le milieu pour une co-culture dans l’obscurité. Soumettez les cellules à des stimulations magnétiques répétées, comme démontré précédemment. Vaporisez de l’alcool sur la plaque pour la stériliser avant de la remettre dans l’incubateur. Après une période de co-culture avec des fragments de myéline, laver doucement les débris de myéline non absorbés avec du PBS. Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de PBS contenant 10 % d’albumine sérique d’âne et 0,3 % de Triton X-100 dans les puits et incuber. Après avoir lavé les puits avec du PBS, ajoutez une solution d’anticorps primaires dans un rapport de 100 à 200 dans les puits et incubez à froid. Ensuite, incubez les cellules dans un anticorps secondaire dans un rapport de 100 à 300 pendant deux heures à température ambiante avant d’obtenir une imagerie au microscope confocal. Les cellules microgliales BV-2 ont montré une réduction significative de la phagocytose des débris de myéline après un traitement par lipopolysaccharide. qui a été inversé lors d’une intervention répétée de stimulation magnétique. L’analyse quantitative a confirmé une diminution significative de la surface des débris de myéline dans les cellules BV-2 dans le groupe lipopolysaccharide par rapport au groupe témoin, avec une augmentation notable dans le groupe traité par lipopolysaccharide stimulé magnétiquement. Le pourcentage de microglie IBA-1 positive co-localisée avec des débris de myéline était significativement plus faible dans le groupe LPS par rapport au groupe témoin, tandis que la stimulation magnétique augmentait significativement ce pourcentage. Une augmentation de la phagocytose microgliale dépendante du temps a été observée chez le groupe traité par lipopolysaccharide stimulé magnétiquement pour notre groupe montrant une absorption de débris de myéline significativement plus élevée.