Cryosectionnement et immunomarquage du tissu de l’oreille interne de souris : du stade embryonnaire au stade adulte

Mes recherches portent sur le neurodéveloppement de la cochlée. Plus précisément, je vise à découvrir les mécanismes sous-jacents de la formation de SNAPS dans la cochlée et à étudier le lien entre la maladie d’Alzheimer et la perte auditive. L’imagerie en direct et les outils génétiques améliorent notre capacité à étudier plus en détail les structures cochléaires et les circuits neuronaux, fournissant des informations plus approfondies sur la résilience et le dysfonctionnement du système auditeur. En publiant ce protocole, nous voulons aider les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine de l’auditeur, en particulier ceux qui n’ont jamais travaillé avec la cochlée auparavant. Ce guide explique étape par étape comment préparer des échantillons d’oreille interne de souris embryonnaires, nouveau-nées et adultes. Notre objectif est de faciliter les expériences de l’oreille interne et de garantir la fiabilité et la cohérence des résultats. L’immunomarquage en coupe efficace présente plusieurs avantages par rapport à d’autres méthodes, comme l’immunomarquage à montage entier. Il préserve bien les protéines et les acides nucléiques, et crée des sections minces, presque en 2D, ce qui rend les mesures plus précises et cohérentes. Cette méthode permet également de garder tous les types de cellules cochléaires intacts et visibles, améliorant ainsi le culte de l’immunomarquage. Contrairement aux préparations à montage entier, la coupe transversale préserve des structures importantes, comme le ligament spiralé, la strie vasculaire, la membrane de Reissner et la membrane tectoriale.

[Instructeur] Pour commencer, placez la souris juvénile euthanasiée sur une plate-forme chirurgicale. À l’aide de ciseaux de dissection fines, faites soigneusement une incision médiane le long du cuir chevelu, en commençant par le cou et en s’étendant vers le museau. Ensuite, placez la lame inférieure des ciseaux sur le foramen magnum et la lame supérieure sur le crâne. Coupez la moitié supérieure du crâne jusqu’au nez pour terminer la deuxième coupe. Retirez les ciseaux de la tête partiellement incisée. Placez la lame inférieure des ciseaux au bas du crâne et la lame supérieure au foramen magnum. Coupez la moitié inférieure de la tête jusqu’au nez pour terminer la troisième coupe. À l’aide de pinces fines et de ciseaux, détachez soigneusement tous les tissus mous entourant l’os temporal, y compris le cerveau, les muscles et le tissu conjonctif. Ensuite, placez les demi-têtes de souris dans les puits d’une plaque de 24 puits contenant du PBS. Remplacer le PBS par une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour la fixation et incuber pendant 45 minutes à température ambiante. Après la fixation, rincez le tissu trois fois pendant cinq à 10 minutes avec du PBS. Localisez l’os temporal ou la capsule de l’oreille interne dans la demi-tête de la souris. À l’aide d’une pince fine, détachez soigneusement les tissus mous entourant la capsule de l’oreille interne. Une fois desserré, coupez le tissu autour de la capsule interne de l’oreille. Appliquez ensuite une légère pression sur la zone entourant la capsule interne de l’oreille à l’aide d’une pince pour la libérer complètement. Conservez les échantillons de l’oreille interne dans PBS à quatre degrés Celsius. Pour commencer, placez la souris adulte euthanasiée sur une plate-forme chirurgicale. À l’aide de ciseaux de dissection tranchants, faites une incision médiane le long du cuir chevelu, en commençant par le cou et en s’étendant vers le museau. Repliez la peau pour exposer le crâne lors de la première coupe. Placez la lame inférieure des ciseaux sur le foramen magnum et la lame supérieure sur le crâne. Coupez la moitié supérieure du crâne jusqu’au nez pour terminer la deuxième coupe. Retirez les ciseaux de la tête partiellement incisée. Positionnez la lame inférieure à la base du crâne et la lame supérieure au foramen magnum. Coupez la moitié inférieure de la tête jusqu’au nez le long de la ligne médiane, en évitant les oreilles internes. Pour chaque demi-tête, utilisez des pinces et des ciseaux pour détacher les tissus mous entourant l’os temporal, y compris le cerveau, les muscles et le tissu conjonctif. Ensuite, courbez inverser le tissu du crâne avec les doigts et utilisez le pouce pour appliquer une légère pression sur la face inférieure de l’os temporal. Détachez progressivement l’os de ses attaches environnantes. Une fois la capsule de l’oreille interne retirée, rincez-la abondamment avec du PBS. Placez une parabole Sylgard remplie de paraformaldéhyde à 4 % sous le microscope. Placez une seule capsule de l’oreille interne dans le plat. Examinez l’oreille interne à la recherche de tissus mous ou d’os attachés et retirez-la délicatement. Identifiez la fenêtre ovale et retirez délicatement l’étrier à l’aide d’une pince. Ensuite, à l’aide d’une pince fine, ouvrez un petit trou dans l’apex de la cochlée. À l’aide d’une pipette P20 remplie de paraformaldéhyde à 4 %, rincez la cochlée pour vous assurer que les liquides, comme le sang dilué ou l’endolymphe, sortent par la fenêtre ovale. Transférez la cochlée fixe dans une plaque à 24 puits remplie de paraformaldéhyde à 4 %. Marquez le temps et incubez pendant 30 à 60 minutes en agitant doucement à l’aide d’une bascule ou d’un nutator. Après l’incubation, rincez l’échantillon trois fois pendant cinq à 10 minutes avec du PBS. Après le rinçage final, placez la cochlée dans de l’EDTA de 1,25 millimolaire et laissez-la basculer pendant deux à trois jours à quatre degrés Celsius. Après le traitement EDTA, rincez la cochlée trois fois pendant cinq minutes avec du PBS. Pour commencer, placez la capsule de l’oreille interne disséquée dans une solution de saccharose à 10 % et incubez à température ambiante pendant deux heures. Après l’incubation, remplacez la solution de saccharose à 10 % par du saccharose à 20 % et laissez incuber pendant deux heures supplémentaires. Remplacez ensuite la solution de saccharose à 20 % par du saccharose à 30 % et incubez l’échantillon pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez la moitié de la solution de saccharose à 30 %. Remplissez l’espace avec une température de coupe optimale ou un composé OCT et laissez l’échantillon basculer pendant 30 minutes à deux heures. Transférez les échantillons dans des cryomoules étiquetés remplis de composé OCT. Vérifiez l’orientation de la cochlée dans le cryobloc intégré. Assurer l’oreille interne ; font face aux côtés étroits du Cryomold pour les sections cochléaires standard. Ensuite, placez de la glace sèche dans un petit récipient et ajoutez cinq à 10 millilitres de diméthylbutane. Placez les cryomoules contenant l’OCT et l’échantillon sur la glace carbonique bouillonnante pour congeler rapidement le bloc. Transférez les cryoblocs dans la chambre d’un cryostat pré-refroidi à moins 20 degrés Celsius. Laissez les échantillons s’équilibrer pendant 30 à 60 minutes. À l’aide d’un crayon ou d’un stylo, marquez le côté du cryobloc correspondant à la position cochléaire pour assurer une bonne orientation pour la section. Ensuite, ajoutez une petite flaque d’OCT dans le mandrin et placez le bloc cryo dessus, en vous assurant que le côté large sans la marque de crayon est orienté vers le bas. Placez le mandrin contenant l’OCT et l’échantillon dans la chambre du cryostat réfrigérée, en laissant l’OCT geler complètement. Après quelques minutes, positionnez le mandrin avec l’échantillon sur le support de mandrin avec la marque de crayon pointant vers la droite ou la gauche. Sur un cryostat, coupez le bloc à l’aide d’un réglage de 40 micromètres jusqu’à ce que le tissu devienne apparent. Une fois que le tissu est apparent, prélevez une section de 12 micromètres à l’aide de lames conçues pour la cryosection. Vérifiez l’emplacement de la section au microscope. Si vous approchez des virages cochléaires, continuez à prélever des sections de 12 micromètres, en vérifiant périodiquement la position jusqu’à ce que tous les virages cochléaires aient été sectionnés.