Isolement de populations de cellules myéloïdes et épithéliales vivantes à partir du poumon de souris
31 janvier 2025
Ce protocole détaille l’isolement de populations immunes et non immunes vivantes du poumon de souris à l’état d’équilibre et après une infection grippale. Il fournit également des stratégies de contrôle pour identifier les sous-ensembles de cellules épithéliales et myéloïdes.
Nous étudions la réparation pulmonaire après une infection virale. Nous visons à comprendre les mécanismes par lesquels les cellules immunitaires médient la réparation épithéliale et comment le remodelage après une lésion virale et la réparation ultérieure peuvent avoir un impact sur les futures pathologies de la maladie. Ce protocole aborde l’incompatibilité des digestions pulmonaires optimisées pour les cellules épithéliales et stromales ou les cellules immunitaires.
Nos recherches nécessitent d’isoler des cellules viables dans les compartiments immunitaires et non immunitaires. De plus, nous avons proposé une stratégie de contrôle pour les sous-ensembles épithéliales et macrophages, qui, nous l’espérons, profitera au domaine. Notre laboratoire étudie l’interaction entre les cellules immunitaires et épithéliales dans les voies respiratoires dans des conditions d’état stationnaire et en réponse à des défis environnementaux.
Notre objectif ultime est de déterminer la meilleure façon de moduler cette communication pour améliorer la réparation des tissus et prévenir le développement de maladies. Pour commencer, vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide de ciseaux chirurgicaux fins et d’une pince numéro sept, faites une incision dans l’abdomen et coupez latéralement à travers le péritoine.
Faites une petite entaille dans le diaphragme pour libérer le vide. Ensuite, coupez le diaphragme et la cage thoracique inférieure de la cavité corporelle pour exposer les poumons et le cœur. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 27, perfuser les poumons avec cinq millilitres d’EDTA de deux millimolaires dans le DPBS.
Coupez verticalement à travers le sternum et le long des côtés pour ouvrir la cage thoracique et exposer la trachée. Utilisez des ciseaux fins et une pince numéro sept pour retirer autant de muscle et de tissu conjonctif que possible sans percer la trachée ou les poumons. Ensuite, enveloppez la trachée avec une suture 2/0, en la positionnant comme pour l’attacher, mais ne serrez pas.
Faites une entaille latérale dans la trachée et insérez le cathéter. Ensuite, tirez fermement sur la suture pour fixer le cathéter en place. Gonflez les poumons avec un millilitre de DPBS à l’aide d’une seringue.
Ensuite, tirez lentement sur la seringue pour retirer le DPBS. Regonflez les poumons avec le même DPBS, et encore une fois, tirez sur la seringue pour recueillir le liquide de lavage broncho-alvéolaire, ou BAL. Débranchez la seringue du cathéter tout en laissant le cathéter inséré.
Distribuez la vanne collectée dans un micro-tube de centrifugation. Ensuite, remplissez la même seringue d’un millilitre avec un millilitre de dispase. Fixez la seringue au cathéter et gonflez les poumons avec du dispase.
Tout en retirant le cathéter, resserrez la suture autour de la trachée pour éviter les fuites de dispase. À l’aide de ciseaux, coupez latéralement à travers la trachée. Retirez les poumons de la cavité corporelle en coupant le tissu conjonctif le long de l’arrière de la cage thoracique tout en tirant les poumons et la trachée vers le haut.
Ensuite, retirez le cœur des poumons. Placez les poumons dans cinq millilitres de DPBS sur de la glace. Centrifugeuse à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
A l’aide d’une pipette, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 100 microlitres de RPMI. Pour commencer, disséquez les cinq lobes des poumons prélevés sur la souris et jetez le tissu conjonctif. Hachez le tissu pulmonaire disséqué avec des ciseaux pendant une minute sur une lame de verre.
À l’aide de ciseaux de dissection, transférez le tissu pulmonaire haché dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Ensuite, ajoutez trois millilitres de mélange de digestion et pipetez le mélange de digestion pulmonaire de haut en bas deux à trois fois. Enfin, ajoutez la pastille cellulaire récupérée du BAL remise en suspension dans le RPMI.
Placez le tube à un angle de 45 degrés dans un agitateur orbital réglé à 140 tr/min à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Après l’incubation, retirez le tube du shaker et placez-le sur de la glace. Pipetez le mélange de digestion pulmonaire de haut en bas cinq à six fois.
Filtrez le mélange à travers une crépine de 70 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres. Lavez toutes les cellules restantes à travers le filtre et neutralisez les enzymes avec 10 millilitres de 5 % FBS dans le milieu RPMI. Centrifuger l’échantillon à 600 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirer le surnageant à l’aide d’un aspirateur. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de lyse ACK et incubez pendant trois minutes à température ambiante pour lyser les globules rouges. Ensuite, ajoutez neuf millilitres de PBS et pipetez de haut en bas pour mélanger la solution.
Encore une fois, centrifugez l’échantillon et utilisez un aspirateur à vide pour éliminer le surnageant, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence. Filtrez la suspension à travers une maille de 64 micromètres dans un tube de microcentrifugation pour l’analyse par cytométrie en flux.
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Aperçu
Ce protocole décrit l'isolement de populations immunitaires et non immunitaires vivantes à partir du poumon de souris à l'état stable et après une infection par l'influenza. Il présente des stratégies de sélection pour identifier les sous-populations de cellules épithéliales et myéloïdes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- L'étude porte sur les mécanismes de réparation pulmonaire après une infection virale.
- Comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la réparation épithéliale est essentiel.
- La recherche aborde les difficultés liées à l'isolement de cellules viables provenant de différents compartiments pulmonaires.
- Elle examine les interactions entre les cellules immunitaires et épithéliales dans le tractus respiratoire.
Objectif de l'étude
- Isoler des cellules immunitaires et non immunitaires viables à partir des poumons de souris.
- Élaborer une stratégie de sélection par fenêtrage pour identifier des sous-populations cellulaires spécifiques.
- Étudier l'impact des lésions virales et de la réparation tissulaire sur les pathologies des maladies futures.
Méthodes utilisées
- Isolation de populations vivantes immunitaires et non immunitaires à partir du poumon de souris.
- Stratégies de sélection pour identifier les sous-populations de cellules épithéliales et myéloïdes.
- Analyse des mécanismes de réparation pulmonaire après une infection grippale.
- Évaluation de la communication croisée entre les cellules immunitaires et épithéliales.
Résultats principaux
- Isolation réussie de populations cellulaires distinctes, immunitaires et non immunitaires.
- Identification de sous-populations spécifiques d'épithélium et de macrophages.
- Compréhension approfondie des mécanismes de réparation pulmonaire après une infection virale.
- Contribution à la compréhension des pathologies futures liées aux lésions pulmonaires.
Conclusions
- Le protocole améliore la capacité d'étudier les réponses immunitaires pulmonaires.
- Il fournit des outils précieux pour l'investigation des mécanismes de réparation épithéliale.
- Les résultats pourraient orienter les recherches futures sur les maladies respiratoires.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement simultané de populations vivantes de cellules myéloïdes et épithéliales à partir du poumon de souris permet une interrogation approfondie des échanges intercellulaires dans les modèles de maladies respiratoires. Cette capacité soutient la réduction des risques mécanistiques et renforce la fiabilité prédictive lors des étapes de validation ciblée et de découverte précoce. La méthode améliore la prise de décision au niveau du portefeuille en fournissant des suspensions uniques de cellules de haute qualité et multiparamétriques destinées à des analyses ultérieures.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'étude directe des interactions immunitaires-épithéliales essentielles à la validation ciblée dans les modèles de maladies pulmonaires.
- Permet une détection mécanistique des risques en autorisant l'évaluation fonctionnelle des compartiments immunitaires et non immunitaires.
- Facilite l'interrogation fondée sur des hypothèses des voies de réparation et de remodelage après une lésion.
Développement de tests et criblage
- Fournit des suspensions monocellulaires validées, adaptées aux protocoles de criblage par cytométrie en flux et FACS.
- Améliore la reproductibilité des tests en standardisant l'isolement des cellules au sein des populations immunitaires et épithéliales.
- Permet des stratégies de sélection quantitative pour une identification robuste des sous-populations cellulaires dans les états naïfs comme pathologiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles murins pertinents pour la maladie afin de faciliter la découverte de biomarqueurs translationnels en recherche respiratoire.
- Permet une continuité entre la découverte mécanistique et la validation préclinique en permettant l'analyse des réponses cellulaires spécifiques à une infection ou à une lésion.
- Réduit l'ambiguïté biologique dans les modèles précliniques en capturant des populations cellulaires diverses dans un seul flux opérationnel.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et la recherche préclinique, en soutenant les flux de travail allant de la validation de la cible à l'identification de composés candidats dans des modèles de maladies respiratoires.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la communication croisée entre les cellules immunitaires et épithéliales et l'élucidation des voies impliquées dans la réparation pulmonaire.
- Criblage : Fournit des données reproductibles et quantitatives sur les sous-populations cellulaires pour des criblages ultérieurs de composés ou de facteurs génétiques.
- Analytique : Produit des résultats de cytométrie en flux multiparamétrique destinés à l'analyse comparative de conditions pathologiques et de conditions témoins.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes mécanistiques à des critères précliniques dans des modèles d'infection, d'allergie, de fibrose et de cancer.
- Réutilisation en milieu professionnel : Établit un protocole standardisé et évolutif, adaptable à divers programmes de recherche respiratoire.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur les maladies pulmonaires.
- Valeur opérationnelle : Simplifie l'isolement des cellules, améliore la reproductibilité et favorise l'analyse à haut débit.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en permettant une génération précoce de données robustes et multiparamétriques dans le processus.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles et des modèles à faire progresser.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection pulmonaire chez la souris, digestion enzymatique et analyse par cytométrie en flux.
- Suppose l'accès à un équipement de tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS) et à une infrastructure analytique permettant un établissement de portes multiparamétrique.
- Exige une standardisation interéquipes des stratégies de mise en porte et des protocoles de manipulation des échantillons.
- Adaptable à divers modèles murins de maladies respiratoires, mais peut nécessiter une optimisation selon les paramètres spécifiques.
- La viabilité et le rendement cellulaires dépendent d'une exécution précise des étapes de dissociation enzymatique et mécanique.
