Name: Reprogrammation d’un modèle de macrophages dérivés de monocytes humains pour des essais in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez la reprogrammation des macrophages dérivés de monocytes humains pour l'immunologie et la biologie cellulaire. Cette méthode standardisée in vitro permet d'étudier la plasticité cellulaire et les réponses aux médiateurs lipidiques.

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Ce travail a été soutenu par l’Agence nationale pour la promotion de la science et de la technologie (ANPCyT-FONCYT) par le biais des subventions PICT 2018-3070 et 2021-I-A-00807 à l’E.A.C.S. et PICT 2021-I-A-00716 à l’A.E.E., et par le Conseil national de la recherche scientifique et technique (CONICET) par le biais de la subvention PIP 2022-0763 et par l’Université de Buenos Aires par le biais du Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 pour A.E.E., E.A.C.S. et A.E.E. sont enquêteurs de carrière au CONICET.

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<li>Nowak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+monocyte+profile+in+patients+with+major+depressive+disorder+and+suicide+behaviour+and+how+ketamine+induces+anti-inflammatory+m2+macrophages+by+nmdar+and+mtor%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory m2 macrophages by nmdar and mtor.</a> EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).</li>
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<li>Gattas, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterotypic+tridimensional+model+to+study+the+interaction+of+macrophages+and+glioblastoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro.</a> Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).</li>
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<li>Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macrophage+functions+by+PPAR-alpha%2C+PPAR-gamma%2C+and+LXRS+in+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).</li>
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<li>Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+macrophage+metabolism+and+activation+by+mTOR+and+Akt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling.</a> Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).</li>
<li>Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eif4b+controls+survival+and+proliferation+and+is+regulated+by+proto-oncogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways.</a> Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La différenciation, l’activation et la polarisation des macrophages sont devenues un élément central de l’immunologie, de l’homéostasie tissulaire, de la pathogenèse des maladies et de la résolution de l’inflammation. De plus, l’image émergente selon laquelle les macrophages tissulaires peuvent être dérivés de monocytes circulants dans des conditions d’homéostasie perturbée souligne la nécessité de modèles M-DM précis caractérisés par des phénotypes définis, des programmes transcriptionnels et des voies d’activation....

Les macrophages, identifiés pour la première fois par Metchnikoff pour leur capacité phagocytaire, sont des cellules anciennes fondamentales à la vie des métazoaires. Omniprésents chez les mammifères adultes, ils présentent une remarquable diversité anatomique et fonctionnelle. En tant que partie intégrante du système phagocytaire mononucléaire, aux côtés des cellules dendritiques et des monocytes, les macrophages jouent un rôle crucial dans divers processus biologiques, du développement et de l’homéostasie aux réponses immunitaires contre les agents pathogènes1,2. Les macrophages résidents, spécialisés pour leur microenvironnement tissulaire, agissent comme des sentinelles, surveillant la santé des tissus et répondant aux changements physiologiques et aux menaces externes. Leur plasticité limitée est considérée comme une adaptation évolutive pour maintenir l’homéostasie tissulaire. En revanche, les monocytes recrutés sont plus flexibles et peuvent se différencier en divers phénotypes de macrophages pendant l’inflammation. Cette double influence de l’inflammation et de la niche tissulaire façonne la diversité fonctionnelle des macrophages 3. Ainsi, selon le milieu tissulaire local, les macrophages dérivés des monocytes (M-DM) peuvent se différencier en de nombreux sous-types. Les métabolites locaux, les facteurs de croissance, les cytokines et l’interaction cellule-cellule4,5,6 décrivent leurs phénotypes et fonctions. De plus, les macrophages sont des producteurs clés de facteurs qui atténuent l’inflammation et favorisent la revascularisation et la réparation des tissus7,8.
Étant donné qu’au moins trois armes principales contrôlent la polarisation (extrinsèque, intrinsèque et conditions environnementales tissulaires), la polarisation des macrophages doit être considérée comme multidimensionnelle2. Les principaux obstacles et pièges dans la description de la différenciation et de la polarisation des macrophages sont les conditions expérimentales hétérogènes dans la littérature et l’absence de consensus sur la définition des termes des macrophages dans les expériences in vitro et in vivo9. Néanmoins, une certaine unification des normes expérimentales a commencé pour divers scénarios expérimentaux.
Pour mieux comprendre le champ des macrophages humains, nous avons besoin de modèles in vitro standardisés et bien définis de M-DM pour la liaison, la différenciation, la polarisation, le phénotype et la reprogrammation, ainsi que des fonctions spécifiques. Notre objectif était d’établir un modèle in vitro standardisé de M-DM humain non polarisé, de M0 et de macrophages polarisés par cytokine pour étudier la reprogrammation biaisée du M-DM par cytométrie en flux et PCR en temps réel. Bien que la polarisation des macrophages soit un processus dynamique en raison de leur grande plasticité et de leur capacité à intégrer plusieurs signaux de leur environnement, nous avons caractérisé ici le M-DM non polarisé (M0) et certains états de polarisation in vitro, comme le pro-inflammatoire classique, communément reconnu également comme M1, induit avec l’IFNγ et le LPS. De même, les macrophages M2 de réparation tissulaire et de régulation peuvent être définis comme M2a lorsqu’ils sont induits par l’IL-4 et M2c lorsqu’ils sont stimulés par la dexaméthasone ou l’IL-10. Ces états polarisants capturent un instantané du large spectre du milieu M-DM dans le temps et l’espace, mais nous donnent quelques points cardinaux pour définir la carte analytique où localiser les conditions d’essai.
Malgré la combinaison complexe et dynamique de marqueurs de surface et de programmes transcriptionnels, lors de l’analyse in vitro du M-DM, nous avons défini que CD64, CD206, CD163, CD14 et MERTK peuvent séparer l’état M0 non polarisé, du M1 induit par l’IFNγ/LPS, du M2a induit par l’IL-4 et de l’IL-10 ou de la dexaméthasone induits par cytométrie en flux. De plus, l’expression des gènes IRF1 et CXCL10 a été définie comme spécifique de M1 induit par l’IFNγ/LPS ; transcrits spécifiques d’IRF4, de CCL22 et de TGM2 pour M2a dérivé de l’IL-4 ; et MERTK pour M2c dérivé de la dexaméthasone, fixant des points cardinaux supplémentaires pour comparer la reprogrammation asymétrique du M-DM confronté à différents stimuli ou même co-cultivé avec d’autres types de cellules.

<table><tbody><tr><td>Souris Alexa Fluor 488 anti-humain&nbsp ; CD206 Clone d’anticorps 15-2</td><td>BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.</td><td>Cat# 321113 ; RRID :AB_571874</td><td></td></tr><tr><td>Clone d’anticorps CD64 anti-humain de souris APC 10.1</td><td>BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.</td><td>Cat# 305013 ; RRID :AB_1595539</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 rat anti-souris/humain CD11b Clone d’anticorps M1/70</td><td>BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.</td><td>Cat# 101226 ; RRID :AB_830642</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>Cat# 554714</td><td>kit de fixation/perméabilisation</td></tr><tr><td>Biotine anti-humain MERTK Clone d’anticorps 590H11G1E3</td><td>BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.</td><td>Cat# 367616 ; RRID : AB_2721500</td><td></td></tr><tr><td>Équipement CFX-Connect&nbsp ;</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de sélection CD14 positif pour l’homme ; Cocktail EasySep Sélection Positive ; Nanoparticules magnétiques EasySep ; Easy Sep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td><td>Cat# 18058</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto cytometer&nbsp ;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, États-Unis.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, qualifié, Nouvelle-Zélande</td><td>Gibco&commerce ; &nbsp ; Thermo Fisher Scientific Waltham, MA États-Unis&nbsp ;</td><td>Cat# 10091148</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS Cytiva</td><td>GE Healthcare - Life Sciences, USA</td><td>Cat# 17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC.</td><td>RRID :SCR_008520</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism&nbsp ; &nbsp ;</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>RRID :SCR_002798</td><td></td></tr><tr><td>kit de synthèse d’ADNc iScript, comprend un mélange de réaction de transcription inverse 5x, une transcriptase inverse iScript, de l’eau sans nucléase</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, États-Unis</td><td>Cat# 1708891</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre spatial CyFlow Partec&nbsp ;</td><td>Sysmex Partec, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Streptavidin</td><td>BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.</td><td>Cat# 405203</td><td></td></tr><tr><td>souris PE/Cy7 Clone d’anticorps CD14 humain HCD14</td><td>BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.</td><td>Cat# 325618 ; RRID :AB_830691</td><td></td></tr><tr><td>Souris PerCP/Cy5.5 Clone d’anticorps anti-humain CD163 GHI/61</td><td>BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.</td><td>Cat# 333607 ; RRID :AB_1134006</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco&trade ; &nbsp ; Thermo Fisher Scientific Waltham, MA États-Unis&nbsp ;</td><td>Cat# 11875119</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, il contient des anticorps Sso7d fusi&oacute ; n polymérase, dNTPs, MgCl2, SYBR Green I Dye, exhausteurs, stabilisants et un mélange de colorants de référence passifs (y compris ROX et fluorescéine).</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, États-Unis</td><td>Cat# 1725271</td><td></td></tr><tr><td>Réactif TriZol</td><td>Thermo Fisher Scientific Life Sciences Solutions Carlsbad, CA, États-Unis&nbsp ;</td><td>Cat#&nbsp ; 15596026</td><td>réactif d’extraction d’ARN</td></tr><tr><td>Zombie Violet Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.</td><td>Cat# 423113</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogrammation d’un modèle de macrophages dérivés de monocytes humains pour des essais in vitro

Reprograming Model of Human Monocyte-derived Macrophages for In-vitro Assays

Les cellules de la lignée monocyte-macrophage sont multifonctionnelles et se trouvent dans presque tous les tissus du corps. Ils coordonnent les phases d’initiation et de résolution de l’immunité innée et adaptative, affectant de manière significative l’immunité protectrice et les lésions pathologiques à médiation immunitaire. Alors que les macrophages résidents des tissus sont des acteurs clés dans le maintien de l’homéostasie à l’état d’équilibre, de grandes quantités de monocytes sont recrutées dans le sang périphérique dans les tissus à la suite de lésions ou d’agressions inflammatoires. Les macrophages dérivés de monocytes (M-DM) peuvent se différencier en de nombreux sous-types dynamiques, et leurs phénotypes et fonctions dépendent de l’environnement tissulaire local. 
Pour comparer différents stimuli ou conditions environnementales lors de la différenciation et de la polarisation du M-DM, nous avons normalisé un modèle in vitro de M-DM humain non polarisé M0 et de certains macrophages cardinaux polarisés par cytokines, M1 dérivé de l’IFNγ/LPS, M2a dérivé de l’IL-4 et M2c dérivé de l’IL-10 ou de la dexaméthasone, afin d’analyser la reprogrammation biaisée du M-DM par cytométrie en flux et PCR en temps réel. Nous avons constaté que CD64, CD206, CD163, CD14 et MERTK peuvent clairement discriminer M0 non polarisé et M1, M2a et M2c polarisés par cytométrie en flux. De plus, nous avons défini IRF1 et CXCL10 comme des gènes spécifiques pour les transcrits M1-, IRF4-, CCL22-et TGM2 classiques dérivés de l’IFNγ/LPS pour les transcrits M2a dérivés de l’IL-4, et le gène MERTK pour le M2c dérivé de la dexaméthasone. Pour résumer, notre protocole M-DM standardisé pourrait donner la carte cardinale in vitro pour analyser la différenciation et la polarisation du M-DM humain sous divers stimuli.

Sur la base de nos travaux menés depuis plusieurs années sur la caractérisation des macrophages, nous avons défini une combinaison précise de marqueurs permettant clairement de distinguer les différents sous-ensembles de M-DM in-vitro. Les marqueurs phénotypiques ont été sélectionnés d’après la littérature scientifique et un criblage préalable approfondi que nous avions précédemment réalisé9,14,15,<sup class=...

Les monocytes et les macrophages sont des cellules immunitaires très plastiques et reprogrammables cruciales pour la santé et la maladie. Ils détectent et répondent à un large éventail de stimuli en adoptant des programmes de différenciation et des phénotypes spécifiques. Nous avons normalisé un modèle in vitro pour étudier la polarisation et la reprogrammation des macrophages, ce qui constitue un outil précieux pour la recherche.

Reprogrammation d’un modèle de macrophages dérivés de monocytes humains pour des essais in vitro

Cells of the monocyte-macrophage lineage are multifunctional and found in almost all body tissues. They coordinate innate and adaptive immunity&#180;s ...

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous démontrons le test d’efférocytose pour étudier la clairance des cellules apoptotiques à l’aide de la microscopie confocale. L’efférocytose est un processus en plusieurs étapes où les cellules apoptotiques sont englouties par des phagocytes et dégradées dans des vésicules appelées efférosomes. Ce protocole fournit une méthode pour visualiser les parties internalisées et non internalisées des cellules apoptotiques individuelles et quantifier l’efférocytose.

Dosage de l’efférocytose à cellules fixes : méthode d’étude de l’absorption efférocytaire des cellules apoptotiques par les macrophages à l’aide de la microscopie à fluorescence

Cette vidéo montre l’amorçage des monocytes primaires dans les macrophages. Les monocytes humains primaires peuvent être isolés et différenciés en un phénotype pro-inflammatoire de type M1 à l’aide du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) ou en un phénotype anti-inflammatoire de type M2 à l’aide du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF).

Culture in vitro et différenciation des monocytes primaires en macrophages

Cette vidéo démontre l’activation des protéines caspase dans les macrophages humains à l’aide de protéines rapporteures de complémentation de fluorescence bimoléculaire. Les pro-domaines de la caspase-1 sont fusionnés avec des fragments non fluorescents de protéines de Vénus, qui sont recrutés dans des complexes d’inflammasome. La proximité des inflammasomes induit le repliement et la fluorescence des fragments de Vénus, confirmant l’activation des caspases dans les macrophages.

Visualisation de l’activation de la caspase dans des macrophages dérivés de monocytes humains

Macrophages dérivés de monocytes sont des cellules importantes du système immunitaire inné. Ici, nous décrivons un outil facile à...

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Un protocole est présenté pour la culture cellulaire de macrophages dérivés de monocytes humains différenciés par le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Le protocole utilise la cryoconservation des monocytes associée à leur différenciation en macrophages. Ensuite, les macrophages récoltés peuvent ensuite être ensemencés dans des puits de culture aux densités cellulaires requises pour la réalisation d’expériences.

Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

Présenté ici est un protocole pour détecter la production de pièges extracellulaires macrophages (MET) dans la culture cellulaire vivante en utilisant la microscopie et la coloration de fluorescence. Ce protocole peut être étendu pour examiner des marqueurs spécifiques de protéine de MET par coloration d'immunofluorescence.

Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

Ce protocole décrit la génération robuste de macrophages des cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et les méthodes pour leur caractérisation ultérieure. L’expression de marqueur de surface de cellules, l’expression de gène, et les essais fonctionnels sont employés pour évaluer le phénotype et la fonction de ces macrophages iPSC-dérivés.

Production et caractérisation des macrophages humains à partir de cellules souches pluripotentes

Nous présentons ici un protocole détaillé d’évaluation du potentiel immunomodulateur des surfaces d’implants in vitro, dans le but d’améliorer la fiabilité et la reproductibilité des protocoles actuels et de promouvoir la poursuite des recherches. Les profils de cytokines sécrétoires, l’expression de l’ARNm et les marqueurs de surface cellulaire ont été surveillés à l’aide de macrophages dérivés de monocytes sanguins pour étudier la polarisation des macrophages cultivés sur du titane.

Polarisation et caractérisation de macrophages dérivés de monocytes humains M1 et M2 sur des surfaces d’implants 

Étant donné le nombre limité de modèles de xénogreffes disponibles pour étudier les interactions entre les cellules CART humaines et les cellules myéloïdes, nous avons établi des modèles in vitro et in vivo pour comprendre les impacts des macrophages humains sur les cellules CART. Les résultats peuvent potentiellement être généralisés pour évaluer les rôles des macrophages dans le microenvironnement tumoral et tester des immunothérapies ciblées sur les macrophages.

Étude des interactions entre les cellules myéloïdes et les cellules CAR-T in vitro et in vivo

Découvrez la reprogrammation des macrophages dérivés de monocytes humains pour l'immunologie et la biologie cellulaire. Cette méthode standardisée in vitro permet d'étudier la plasticité cellulaire et les réponses aux médiateurs lipidiques.

Reprogrammation d’un modèle de macrophages dérivés de monocytes humains pour des essais in vitro

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