Reprogrammation d’un modèle de macrophages dérivés de monocytes humains pour des essais in vitro

Notre recherche a porté sur la lignée des monocytes et des macrophages, en mettant l’accent sur sa plasticité remarquable et sa capacité à intégrer plusieurs signaux de l’environnement pour façonner la réponse effectrice pendant l’inflammation, la réparation des tissus et les infections. Les macrophages sont présents dans tout le corps et coordonnent l’initiation et la résolution de l’immunité innée et adaptée ayant un impact sur la pathologie protégée et à médiation immunitaire. La reprogrammation des macrophages est la caractéristique la plus prometteuse dans ce domaine.

Les technologies omiques émergentes ont révolutionné notre compréhension de la biologie des macrophages, en donnant un aperçu de leur diversité phénotypique, de leurs caractéristiques fonctionnelles, de leur potentiel de programmation et de l’origine développementale de ces cellules. Le principal obstacle et piège dans la découverte de la différenciation et de la polarisation des macrophages est l’hétérogénéité des conditions et des protocoles expérimentaux dans la littérature et l’absence de consensus dans la définition du terme macrophage. Nous démontrons l’effet de reprogrammation des médiateurs médicamenteux et lipidiques sur la polarisation des macrophages et développons un modèle 3D in vitro de l’interaction entre les cellules de macrophage et de glioblastome.

De plus, nous avons montré que les plaquettes permettent la différenciation des macrophages dérivés des monocytes au phénotype N1. Pour commencer, placez des échantillons de sang périphérique anticoagulé dans une centrifugeuse. Faites-le tourner à 200G pendant 15 minutes à température ambiante.

Observez la séparation du plasma riche en plaquettes en haut et de la fraction cellulaire, y compris les globules rouges et blancs, en dessous. Diluer la fraction cellulaire obtenue lors de la première centrifugation avec du PBS stérile préchauffé à température ambiante. Homogénéiser doucement la solution avant de procéder à la centrifugation par gradient de densité Ficoll-Hypaque.

Transvasez 15 millilitres de Ficoll-Hypaque dans un tube stérile de 15 millilitres. Ajoutez soigneusement et lentement 30 millilitres de sang dilué sur le Ficoll, en veillant à ce qu’un mélange minimal entre les phases soit minimal. Centrifugez le tube contenant le Ficoll et le sang dilué à 600G pendant 25 minutes à température ambiante.

À l’aide d’une pipette Pasteur stérile de trois millilitres, retirez une partie de la couche supérieure jaune. Prélever soigneusement l’interface entre la couche jaune et la couche de Ficoll à l’aide d’une pipette Pasteur stérile. Transférez les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) collectées dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant au moins trois millilitres de PBS stérile.

Remplissez le tube avec du PBS stérile pour atteindre un volume total de 12 à 15 millilitres. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 600G pendant 10 minutes. Ensuite, faites tourner la suspension PBMC à 300 G pendant cinq minutes à 8 à 10 degrés Celsius.

Remettre les cellules en suspension dans le volume souhaité de PBS froid stérile avec 2 % de FBS. Gardez les cellules à 4 degrés Celsius jusqu’à l’étape suivante. Transférez le volume souhaité de suspension PBMC dans un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres.

Ajoutez ensuite 10 microlitres de cocktail de sélection positive pour 100 microlitres de suspension cellulaire. Mélangez soigneusement la suspension avant de l’incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, pipetez 10 microlitres de nanoparticules magnétiques pour 100 microlitres de suspension cellulaire.

Pipetez vigoureusement de haut en bas plus de cinq fois pour assurer une suspension uniforme des nanoparticules magnétiques. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, ajoutez du PBS contenant du FBS et de l’EDTA à la suspension pour porter le volume total à 2,5 millilitres. Pipetez doucement les cellules de haut en bas deux à trois fois.

Insérez le tube dans le trieur à aimants et laissez-le reposer sans être dérangé pendant cinq minutes. Retournez l’aimant avec le tube dans un mouvement continu. Gardez l’aimant et le tube inversés pendant deux à trois secondes avant de les remettre en position verticale.

Retirez le tube de l’aimant, puis ajoutez à nouveau 2,5 millilitres de tampon PBS-FBS-EDTA dans le tube. Pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas deux à trois fois pour la mélanger. Réinsérez le tube dans l’aimant et mettez-le à l’écart pendant cinq minutes.

En un mouvement continu, retournez à nouveau l’aimant et le tube, en éliminant la fraction surnageante. Retirez le tube de l’aimant et remettez les cellules en suspension dans un volume approprié de PBS-FBS sans EDTA. Les cellules sélectionnées positivement sont maintenant prêtes à l’emploi.

Ajoutez maintenant le tampon PBS-FBS aux cellules CD14 triées, ce qui porte le volume total à 12 à 14 millilitres pour diluer tout EDTA restant. Centrifuger à 600G pendant 10 minutes. Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension les monocytes CD14 sélectionnés positivement dans deux millilitres de tampon PBS-FBS.

Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatique. Conservez les cellules sur de la glace jusqu’à la préparation de la culture. Pour la culture, remettre la pastille en suspension à une concentration d’un million de cellules par millilitre dans un milieu RPMI 1640 supplémenté.

Pipeter 250 microlitres de la suspension cellulaire préparée dans chaque puits d’une plaque de 48 puits. Ajoutez 250 microlitres de milieu RPMI supplémenté en antibiotiques contenant 50 nanogrammes par millilitre de facteur de stimulation des colonies de macrophages dans chaque puits. Incuber la plaque de culture cellulaire dans un incubateur humidifié pour initier la différenciation des macrophages.

Au quatrième jour de la différenciation des macrophages, remplacez la moitié du milieu de culture de chaque puits. Ajoutez des cytokines ou des réactifs pour les conditions de polarisation souhaitées et poursuivez la culture pendant trois jours supplémentaires. Récoltez les monocytes dérivés des macrophages le septième jour pour la caractérisation phénotypique.

Les macrophages M1 induits par l’interféron gamma-plus lipopolysaccharide présentaient l’expression la plus élevée de CD64, une absence de CD206 et de faibles niveaux de CD163 et de MERTK. Les macrophages M2a induits par l’interleukine 4 ont été caractérisés par une augmentation de l’expression de CD206 et une réduction des niveaux de CD64, CD163 et MERTK. Les macrophages M2c induits par l’interleukine 10 ou la dexaméthasone ont montré une augmentation de l’expression de CD163 et CD14, des niveaux intermédiaires de CD64 et une augmentation de l’expression de MERTK.