Name: Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Découvrez la technique EASI-FISH pour visualiser l'expression génique multiplex dans le cerveau intact de Drosophila. Cette méthode combine microscopie d'expansion et hybridation in situ par fluorescence itérative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Paul Tillberg pour ses conseils sur la dynamique de la microscopie à expansion, Christina Christoforou pour son aide avec les dissections cérébrales, et Geoffrey Meissner pour ses commentaires critiques. Nous remercions également Tanya Wolff et Gerry Rubin, ainsi que Geoffrey Meissner et Wyatt Korff, de nous avoir permis d’inclure les résultats générés dans le cadre de deux études plus vastes. Tous les travaux ont été effectués au campus de recherche Janelia et soutenus par l’Institut médical Howard Hughes grâce à des fonds versés aux équipes du projet MultiFISH et Fly-eFISH, à Gerry Rubin et aux ressources techniques du projet.

Ce protocole a été réalisé sur des femelles adultes (âgées de 5-6 jours) de Drosophila melanogaster, mais n’importe quel sexe ou espèce de drosophile est applicable. Pour les recettes d’ancrage en gel, voir le tableau supplémentaire 1 ; pour la recette de gel, tableau supplémentaire 2 ; et pour les autres réactifs EASI-FISH, le tableau supplémentaire 3. Pour un guide quotidien sur les matériaux et les réactifs, voir le tableau supplémentaire 4. Pour le support de gel pour microscope à feuillet de lumière, voir le fichier supplémentaire 1. La figure 1A-C montre une représentation schématique de l’encastrement des cerveaux dans les gels avant l’expansion et l’hybridation de la sonde (étapes 2.1 à 3.8). La figure 1D est une photographie des cerveaux intégrés, La figure 1E montre un support de gel pour la microscopie à feuillet de lumière, et Figure 1F représente la chronologie d’une expérience typique. Les détails commerciaux des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Dissection et fixation du cerveau de la mouche
<ol>
	<li>Disséquer des cerveaux de mouches ou le SNC dans un milieu S2 froid (pour plus de détails sur la dissection, voir reference21)</li>
	<li>Pour réparer les cerveaux, ajoutez jusqu’à 20 cerveaux ou 10 SNC à 2 ml de PFA/PBS froid à 4 % et incubez toute la nuit sur un nutator à 4 °C 
	ATTENTION : Le PFA est nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation, irritant pour la peau et les yeux et peut être cancérigène.</li>
	<li>Rincer l’échantillon (1x) avec 2 mL de PBT froid (0,5 %, voir le tableau supplémentaire 4), puis laver l’échantillon avec 2 mL de PBT froid (4x) pendant 15 min sur un nutator à 4 °C.</li>
	<li>Rincer l’échantillon (1x) avec 2 mL d’EtOH froid à 70 %. Conservez la cervelle dans 2 mL d’EtOH à 70 % à 4 °C jusqu’à 6 mois.</li>
</ol>
2. Montage des cerveaux et ajout d’ARN et de liaisons protéiques (Jour 1)
REMARQUE : Portez des gants en tout temps et essuyez systématiquement l’équipement et l’espace de travail avec RNase Away. Des gants sont nécessaires (1) pour éloigner les RNases des échantillons et (2) pour se protéger de plusieurs réactifs qui présentent un risque pour la santé.
<ol>
	<li>Préparez les chambres de gel en essuyant une lame non chargée avec un réactif de décontamination RNase. Retirez le film opaque protégeant l’adhésif du joint en silicone, collez le joint (avec jusqu’à 4 chambres) sur la lame et enduisez chaque surface de chambre de 1 μL de poly-lysine à l’aide d’une pointe de pipette P20. Sécher à l’air libre et répéter le processus. 
	REMARQUE : L’étape 2.1 peut être effectuée la veille.</li>
	<li>Transférez les cerveaux dans un tube PCR de 0,2 mL (jusqu’à 4 cerveaux par tube) et réhydratez-les pendant (2x) 5 min dans 150 μL de PBT (0,1 %) et (2x) pendant 5 min dans PBS.</li>
	<li>Pour monter les cerveaux, ajoutez 40 μL de PBS par chambre, puis enfoncez doucement les cerveaux en rangée au centre de la chambre avec une pince à épiler fine, en laissant un peu d’espace entre les cerveaux (voir Figure 1D). Il est possible de monter jusqu’à 6 cerveaux ou 2 CNS par chambre.</li>
	<li>Retirez le PBS et ajoutez immédiatement 50 μL de tampon MOPS de 20 mM. Incuber pendant 30 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Pendant que les cerveaux s’équilibrent dans le tampon MOPS, décongelez les solutions mères de Melphalan-X et d’Ac-X et préparez 75 μL de solution de Melphalan-X/Ac-X par chambre (diluez le stock de Melphalan-X 1:1 avec le tampon MOPS et ajoutez Ac-X à 1:100). Vortex et tournez brièvement pour recueillir la solution ; chronométrer la préparation de manière à ce que la solution soit prête à la fin du temps d’incubation de 30 minutes, et non plus tôt. 
	MISE EN GARDE : Melphalan-X est nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation, irritant pour la peau et les yeux et peut être cancérigène.</li>
	<li>Retirez toute la mémoire tampon MOPS et ajoutez 50 μL de solution Melphalan-X/Ac-X.</li>
	<li>Couvrez la chambre en plaçant une lamelle sur le dessus, mais n’utilisez pas l’adhésif du joint pour sceller. Placez la chambre dans une boîte humidifiée et incubez à l’abri de la lumière pendant la nuit à RT.</li>
</ol>
3. Gélification et digestion de la protéinase K (Jour 2)
<ol>
	<li>Retirez soigneusement la lamelle et le Melphalan-X/Ac-X, et lavez les cerveaux montés (2x) pendant 2 min avec 100 μL de PBT (0,1 %) et (1x) pendant 2 min avec 100 μL de PBS.</li>
	<li>Décongelez la solution TREx-1000, 4HT, TEMED et APS et restez sur la glace. 
	REMARQUE : TREx-1000 peut précipiter à -20 °C ; bien vortex pour se dissoudre complètement après décongélation. 
	ATTENTION : Ces réactifs sont nocifs ou toxiques lorsqu’ils sont avalés ou inhalés, ainsi que des irritants cutanés et oculaires.</li>
	<li>Préparez la solution de gel en mélangeant TREx-1000 avec 4HT, TEMED et APS dans un rapport de 94:2:2:2. Vortex et restez sur la glace. Pour chaque chambre, préparer 150 μL de solution gélatineuse.</li>
	<li>Retirez le PBS de la chambre à l’aide d’une pointe de pipette et évacuez soigneusement tout PBS restant avec une lingette non pelucheuse. Pour chaque chambre, ajoutez immédiatement 40 μL de solution de gel sur le dessus du cerveau. Incuber à 4 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Retirer la solution gélifiée et ajouter 40 μL de solution gélifiée fraîche, en laissant incuber à 4 °C pendant 10 minutes supplémentaires < >
	REMARQUE : Recueillir la solution de déchets de gel dans un tube de microcentrifugation et polymériser avant de la jeter.</li>
	<li>Retirez la solution de gel et décollez le film protecteur transparent de l'adhésif de surface du joint. Ajoutez 45 μL de solution de gel frais, placez doucement une lamelle sur la chambre et évitez de piéger les bulles d’air. Appuyez sur la lamelle pour sceller la chambre et incubez à 4 °C pendant 10 min (pour un total de 30 min d’équilibrage à 4 °C).</li>
	<li>Polymériser le gel à 37 °C pendant 1,5 h.</li>
	<li>Une fois que les gels ont pris, laissez-les refroidir sur la paillasse pendant quelques minutes. Retirez délicatement la lamelle et retirez le joint en silicone avec une nouvelle lame de rasoir. Ensuite, coupez le gel en un rectangle et coupez le coin supérieur droit pour suivre l’orientation de l’échantillon.</li>
	<li>Retirez les gels de la lame à l’aide d’un pinceau fin imbibé d’une petite quantité de tampon ProK et transférez-les individuellement dans des tubes de microcentrifugation de 2 ml.</li>
	<li>Incuber chaque gel avec 500 μL de tampon ProK et 5 μL d’enzyme ProK (1:100) à 37 °C pendant la nuit.</li>
</ol>
4. Digestion de l’ADN et hybridation de la sonde (Jour 3)
<ol>
	<li>Laver les gels (3x) pendant 10 min avec 1 mL de PBS à RT. 
	REMARQUE : Utilisez des pipettes de transfert à pointe fine pour éviter d’endommager le gel lors du remplacement des solutions.</li>
	<li>Incuber les gels pendant 30 min dans 1 mL de tampon DNase1 à 37 °C.</li>
	<li>Ajoutez 50 μL d’enzyme DNase1 à 450 μL de tampon DNase. Mélangez doucement, mais ne vortex pas. Incuber chaque gel dans 500 μL de DNase1 pendant 2 h 37 °C. Laver (4x) 15 min avec 1 mL de PBS à RT. 
	REMARQUE : Les gels peuvent être stockés dans 5x SSC à 4 °C avant ou après la digestion/lavage de la DNase pendant plusieurs semaines.</li>
	<li>Hybridation par dégel (hyb) et tampon de lavage par sonde. Incuber les gels dans 500 μL de tampon hyb sans sonde pendant 30 min à 37 °C. 
	ATTENTION : Le tampon de lavage hyb et sonde contient du formamide, qui est suspecté de provoquer le cancer.</li>
	<li>Diluer les sondes 1:100 dans un tampon hyb (10 nM), en préparant 300 μL par gel. Incuber les gels avec le tampon hyb et les sondes pendant la nuit à 37 °C. Maintenez le tampon de lavage de la sonde et le PBS à 37 °C.</li>
</ol>
5. Lavages de la sonde (Jour 4)
<ol>
	<li>Laver les gels (3x) pendant 30 min avec 750 μL de tampon de lavage de sonde à 37 °C.</li>
	<li>Lavez les gels (3x) pendant 30 min, puis (3x) pendant 1 h avec 1 mL de PBS à 37 °C.</li>
	<li>Lavez les gels dans 2 ml de PBS à RT pendant la nuit ou à 4 °C pendant le week-end.</li>
</ol>
6. Réaction en chaîne d’hybridation (HCR) avec des épingles à cheveux fluorescentes (Jour 5)
NOTE : Pour le principe HCR, voir reference22.
<ol>
	<li>Incuber les gels dans 500 μL de tampon d’amplification (amp) pendant 30 min à RT.</li>
	<li>Chauffez les épingles à cheveux fluorescentes à 95 °C pendant 90 secondes dans une machine PCR et refroidissez rapidement à 25 °C pendant 30 minutes.</li>
	<li>Pour chaque sonde, diluer les paires d’épingles à cheveux correspondantes (h1 et h2) à 1:50 dans un tampon ampères, en préparant 300 μL par gel et vortex.</li>
	<li>Incuber les gels avec le mélange en épingle à cheveux pendant 3 h à RT dans l’obscurité.</li>
	<li>Lavez les gels (2x) pendant 15 min avec 750 μL de 5x SSCT et (2x) pendant 30 min avec 1 mL de SSCT 0,5x à RT.</li>
	<li>Si le cerveau exprime la GFP, colorer avec 500 μL d’anticorps anti-GFP-AF488 (1:500) dans du PBT (0,1 %) contenant 5 mg/mL de BSA ultra-pur et incuber pendant la nuit (ou le week-end) à 4 °C.</li>
</ol>
7. Montage des gels et imagerie (Jour 6)
<ol>
	<li>Après l’incubation de l’anticorps, rincez une fois les gels et lavez-les (1x) pendant 30 min avec 1 mL de PBT (0,1 %), puis (3x) pendant 30 min avec 1 mL de PBS. 
	REMARQUE : Le lavage en PBS entraînera une expansion 2x ; pour une expansion 3x, laver avec 0,05x SSC.</li>
	<li>Pendant le lavage, enduire deux fois la surface de fixation en gel du support de gel pour microscope à feuille de lumière avec 1 μL de polylysine, en laissant sécher à 37 °C entre les couches. De même, pour l’imagerie confocale, enduire la zone de fixation en gel d’une parabole à fond de verre avec des applications répétées de polylysine.</li>
	<li>Techez les gels pendant 30 min à RT dans 1 mL de 5 μg/mL DE DAPI/PBS ou DAPI/0,05x SSC, ou alternativement, colorez toute la nuit à 4 °C.</li>
	<li>Pour monter le gel sur le support de gel (microscope à feuille de lumière) ou sur la parabole à fond de verre (microscope confocal), placez le gel sur une lamelle et séchez soigneusement les bords avec une lingette non pelucheuse. Assurez-vous que le gel est orienté de manière à ce que le tissu soit le plus proche de l’objectif. À l’aide d’un pinceau, placez délicatement le gel sur la surface en polylysine en un seul mouvement. Pour l’imagerie, baignez le gel dans du PBS (ou 0,05x SSC si vous passez à 3x). 
	REMARQUE : Après l’imagerie, les gels peuvent être délicatement retirés de la surface en polylysine avec un pinceau humide et transférés dans un tube de microcentrifugation de 2 ml.</li>
	<li>Pour un nouveau sondage immédiat, passez au jour 7. Pour un stockage à plus long terme (1 semaine à 6 mois), stocker les gels dans 1 mL de 5x SSC à 4 °C. Au moment de l’utilisation, laver les gels (3x) pendant 10 min avec 1 mL de PBS avant de continuer. 
	REMARQUE : L’étendue de l’expansion est généralement cohérente dans les tampons décrits (~2x en PBS et ~3x en SSC 0,05x). Pour vérifier le facteur d’expansion, mesurez la taille d’un cerveau avant et après l’expansion sur des images prises au stéréomicroscope à fluorescence. Pour visualiser le cerveau après expansion, colorez-le brièvement avec du DAPI. Le facteur d’expansion approximatif est la taille après expansion divisée par la taille avant l’expansion.</li>
</ol>
8. Sondes de décapage et épingles à cheveux pour multiplexage (Jour 7)
<ol>
	<li>Incuber les gels pendant 30 min dans 1 mL de tampon DNase1 à 37°C.</li>
	<li>Ajoutez 50 μL de DNase1 à 450 μL de tampon DNase. Mélangez doucement, mais ne vortex pas. Incuber les gels dans 500 μL de DNase1 pendant 2 h à 37 °C.</li>
	<li>Laver (4x) pendant 15 min avec 1 mL de PBS à RT. Les gels sont maintenant prêts pour le prochain cycle d’hybridation (Jour 3, étape 6).</li>
</ol>

<ol><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+method+for+mapping+genes+on+phila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+in+situ+hybridization+-+A+personal+history%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The origin of in situ hybridization - A personal history.</a> Methods. 98, 4-9 (2016).</li>
<li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Rep. 46 (2), 65-72 (2013).</li>
<li>Long, X., Colonell, J., Wong, A. M., Singer, R. H., Lionnet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mRNA+imaging+throughout+the+entire+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative mRNA imaging throughout the entire Drosophila brain.</a> Nat Methods. 14 (7), 703-706 (2017).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+for+quantitating+post-transcriptional+regulation+in+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization for quantitating post-transcriptional regulation in Drosophila brains.</a> Methods. 126, 166-176 (2017).</li>
<li>Meissner, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neurotransmitter+identity+in+the+whole-mount+Drosophila+brain+using+multiplex+high-throughput+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping neurotransmitter identity in the whole-mount Drosophila brain using multiplex high-throughput fluorescence in situ hybridization.</a> Genetics. 211 (2), 473-482 (2019).</li>
<li>Duckhorn, C. J., Junker, I. P., Ding, Y., Shirangi, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+in+situ+hybridization+chain+reaction+and+immunostaining+to+visualize+gene+expression+in+whole-mount+Drosophila+central+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Combined in situ hybridization chain reaction and immunostaining to visualize gene expression in whole-mount Drosophila central nervous systems.</a> Behavioral Neurogenetics. 181, 1-14 (2022).</li>
<li>Eng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-scale+super-resolved+imaging+in+tissues+by+RNA+seqFISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH.</a> Nature. 568 (7751), 235-239 (2019).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+cell+atlas+of+the+mouse+primary+motor+cortex+by+MERFISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH.</a> Nature. 598 (7879), 137-143 (2021).</li>
<li>Janssens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+in+adult+Drosophila+reveals+new+cell+types+in+the+brain+and+identifies+subcellular+mRNA+patterns+in+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics in adult Drosophila reveals new cell types in the brain and identifies subcellular mRNA patterns in muscles.</a> eLife. 13, RP92618(2024).</li>
<li>Gandin, V., et al. Deep-tissue spatial omics: Imaging whole-embryo transcriptomics and subcellular structures at high spatial resolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGandin%2C+V+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+single-cell+transcriptome+imaging+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional single-cell transcriptome imaging of thick tissues.</a> eLife. 12, RP90029(2023).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging%3A+Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical imaging: Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nat Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Schwarzkopf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+chain+reaction+enables+a+unified+approach+to+multiplexed%2C+quantitative%2C+high-resolution+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Development. 148 (22), 199847(2021).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EASI-FISH+for+thick+tissue+defines+lateral+hypothalamus+spatio-molecular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization.</a> Cell. 184, 6361-6377 (2021).</li>
<li>Eddison, M., Ihrke, G. Expansion-assisted iterative fluorescence in situ hybridization (EASI-FISH) in Drosophila CNS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEddison%2C+M+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2022).</li>
<li>Meissner, G., et al. A split-GAL4 driver line resource for Drosophila CNS cell types. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeissner%2C+G+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Nern, A., et al. Connectome-driven neural inventory of a complete visual system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNern%2C+A+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>FlyLight Protocol. , HHMI Janelia Research Campus. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols">https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols</a> (2025).</li>
<li>HCR Amplification Technology. , HCR. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.molecularinstruments.com/technology">https://www.molecularinstruments.com/technology</a> (2025).</li>
<li>Wolff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+driver+lines+targeting+the+Drosophila+central+complex+and+their+use+to+investigate+neuropeptide+expression+and+sleep+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific driver lines targeting the Drosophila central complex and their use to investigate neuropeptide expression and sleep regulation.</a> eLife. 14, RP104764(2025).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Watanabe, K., Chiu, H., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+in+situ+mapping+of+neuronal+activation+in+Drosophila+during+social+behaviors+and+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Whole-brain in situ mapping of neuronal activation in Drosophila during social behaviors and optogenetic stimulation.</a> eLife. 12, RP92380(2024).</li>
<li>Damstra, H. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cellular+and+tissue+ultrastructure+using+Ten-fold+Robust+Expansion+Microscopy+%28TREx%29%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx).</a> eLife. 11, e73775(2022).</li>
<li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+state+coding+by+molecularly+defined+paraventricular+hypothalamic+cell+type+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Behavioral state coding by molecularly defined paraventricular hypothalamic cell type ensembles.</a> Science. 370 (6514), abb2494(2020).</li>
<li>Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+Y+%22GitHub%22">GitHub</a>. , (2021).</li>
<li>Park, G., et al. Using Amira to generate cell body masks in fluorescent light sheet microscopy images of EASI-FISH samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+G+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2023).</li>
<li>Bahry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RS-FISH%3A+Precise%2C+interactive%2C+fast%2C+and+scalable+FISH+spot+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RS-FISH: Precise, interactive, fast, and scalable FISH spot detection.</a> Nat Methods. 19 (12), 1563-1567 (2022).</li>
<li>Managan, C., Ihrke, G. EASI-FISH spot counting in Drosophila brain using RS-FISH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManagan%2C+C+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2024).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Le protocole EASI-FISH décrit pour le système nerveux intact de la drosophile permet de détecter des dizaines de transcrits dans le même cerveau ou SNC. Il est robuste, simple et sensible, et il peut être combiné à la détection GFP pour identifier des sous-ensembles de neurones ou de cellules gliales. Comme cette méthode est facile à mettre en œuvre, elle devrait faciliter la recherche des laboratoires de drosophile qui s’intéressent à la cartographie et à la quantification de l’expression des gènes dan...

FISH a été utilisé pour la première fois chez la drosophile il y a plus de 40 ans pour cartographier les gènes sur les chromosomes polytènes1,2. Aujourd’hui, la FISH à molécule unique est l’étalon-or pour localiser et quantifier spatialement les transcrits de l’ARNm dans les tissus intacts 3. Cependant, en raison de problèmes d’intégrité de l’échantillon et de perte d’ARN, les techniques de FISH à molécule unique chez la drosophile ont été limitées à quelques gènes pouvant être analysés dans le même échantillon4,5,6,7. Alors que le développement récent du codage à barres (par exemple8,9,10) augmente le nombre de transcrits pouvant être détectés jusqu’à plusieurs centaines, même dans les tissus épais11,12), la mise en place de tels protocoles nécessite un investissement considérable en ressources, ce qui pourrait constituer un obstacle à la mise en œuvre. En effet, de nombreuses techniques inventives de transcriptomique spatiale ne se sont jamais répandues au-delà de leurs institutions d’origine13. Par conséquent, une méthode simple et relativement peu coûteuse pour détecter l’expression de dizaines de gènes dans le même cerveau intact faciliterait divers objectifs de recherche : validation du séquençage de l’ARN et des données de l’atlas cellulaire, cartographie des types de cellules moléculaires dans le SNC, quantification des différences de développement, de sexe ou d’espèce dans l’expression des gènes, ou mesure des changements dans l’expression des gènes induits par la grande variété de perturbations génétiques ou environnementales disponibles chez la drosophile. 
La microscopie à expansion est une technique qui permet aux chercheurs d’observer les tissus à plus haute résolution en les dilatant dans un hydrogel gonflant14. EASI-FISH combine la microscopie à expansion et l’ARN FISH15, qui utilise la réaction en chaîne d’hybridation (HCR), une technique non enzymatique pour détecter la liaison de l’oligosonde 16. EASI-FISH a d’abord été développé comme une approche alternative à la FISH en tissu mince pour cartographier les modèles d’expression de dizaines de gènes dans des tranches de tissu épais (300 μm) de l’hypothalamus latéral de souris17. Cette méthode est idéale pour une application sur des cerveaux de mouches adultes, étant donné que ce tissu a une épaisseur inférieure à 300 μm, et qu’un prototype de protocole EASI-FISH a récemment été décrit 18. Ici, des cerveaux de drosophile disséqués et fixés sont intégrés dans un hydrogel gonflant, où l’ARNm et les protéines sont ancrés de manière covalente au polymère de gel avec les agents alkylants Melphalan-X et Acryloyl-X (Ac-X), respectivement. Après la digestion des protéines, qui permet l’expansion isotrope du cerveau, des oligosondes d’ADN spécifiques au gène sont hybridées à l’ARNm dans le tissu pour localiser les transcrits d’intérêt. Des épingles à cheveux d’ADN marquées par fluorescence sont ensuite ajoutées dans une deuxième étape d’hybridation. Plusieurs molécules d’épingle à cheveux polymérisent dans la réaction HCR pour former des polymères d’ADN métastables. Cela conduit à une amplification du signal pour les transcrits individuels, qui peuvent être détectés comme des points lumineux par feuillet de lumière ou par microscopie confocale.
L’ancrage covalent de l’ARNm et des protéines dans la matrice du gel et la digestion protéolytique des protéines après la formation du gel créent un environnement où les transcrits de l’ARNm sont relativement stables et potentiellement plus accessibles à la liaison à la sonde. La stabilité de l’ARNm et du gel permet plusieurs cycles de ré-sondage et d’imagerie, avec le stripping des sondes d’ADN et du produit HCR par incubation avec l’enzyme DNase1 entre les tours15,17. De plus, l’expansion de l’échantillon réduit l’autofluorescence et la diffusion de la lumière par désencombrement moléculaire et augmente efficacement la résolution de l’image14. Par conséquent, les transcrits individuels de l’ARNm peuvent être plus facilement résolus.
GFP soutient suffisamment la procédure pour rester détectable par fluorescence ou liaison d’anticorps post-expansion. Par conséquent, ce rapporteur peut être utilisé pour marquer et segmenter les types de cellules d’intérêt. En conjonction avec les nombreuses lignées de pilotes split-GAL4 spécifiques aux neurones disponibles (par exemple, 19,20), cela ouvre la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’identité moléculaire d’un type neuronal ou d’identifier des sous-types moléculaires qui ne peuvent pas être facilement distingués par leur anatomie.
 Décrit ici est une version mise à jour du prototype du protocole EASI-FISH18 qui présente une excellente rétention de l’ARNm, l’élimination des difficultés techniques et une plus grande robustesse du gel. Les modifications comprennent l’augmentation de la concentration de PFA, l’abaissement de la température de fixation et la facilitation de la préparation des échantillons en montant les cerveaux avant l’incubation avec Melphalan-X et Ac-X. Ce protocole intègre également une nouvelle recette de gel pour augmenter la robustesse du gel, ce qui réduit efficacement les dommages causés au gel lors de nombreuses séries de FISH et d’imagerie. Ces modifications rendent le protocole plus simple à mettre en œuvre, réduisant à la fois le temps de traitement et l’utilisation de réactifs, et renforçant la confiance dans des résultats cohérents. Il est important de noter que la capacité de multiplexage est augmentée de sorte que des dizaines de gènes peuvent être étudiés dans le même cerveau sur une période de plusieurs mois. Ceci est illustré par les modèles d’expression de plusieurs gènes neuronaux dans le cerveau de la drosophile adulte à travers une gamme de niveaux d’expression.

<table><tbody><tr><td>Tubes PCR de 0,2 mL</td><td>USA Scientific&nbsp ;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger à bouchon à vis de 0,5 mL, Amber</td><td>USA Scientific&nbsp ;</td><td>1405-9707</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, PH 8, RNase sans</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>10M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>BP 3994</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM 9763</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl sans RNase&nbsp ;</td><td>Thermofisher</td><td>AM97060G</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipette de transfert - Pointe fine</td><td>Global Scientific&nbsp ;</td><td>134070-S20</td><td></td></tr><tr><td>Plaque inférieure en verre à 6 puits&nbsp ;</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile, anhydre&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>042311-K7</td><td></td></tr><tr><td>Acide acrylique</td><td>TCI</td><td>A0141</td><td></td></tr><tr><td>Acryloyl-X&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>A20770</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’amplification&nbsp ;</td><td>Molecular Instruments</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>DMSO anhydre</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>AstA_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR477</td><td></td></tr><tr><td>ChAT_B1</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRG115</td><td></td></tr><tr><td>Crz_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR480</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Open source</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>FMRFa_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR487</td><td></td></tr><tr><td>GAD1_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE581</td><td></td></tr><tr><td>GFP Anticorps polyclonaux, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21311</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’hybridation</td><td>Molecular Instruments</td><td></td><td></td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</tr><tr><td>Imaris Stitcher</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher</td><td></td></tr><tr><td>Imaris viewer</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer</td><td></td></tr><tr><td>JF-669, SE&nbsp ;</td><td>Tocris</td><td>6420</td><td></td></tr><tr><td>Melphalan</td><td>Caymen Chemicals</td><td>16665</td><td></td></tr><tr><td>MOPs Buffer</td><td>Fisher</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>N,N Méthylène-Bis-acrylamide&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T22500</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases&nbsp ;</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Sondes&nbsp ;</td><td>Instruments moléculaires</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td></td><td></td>BP24384</tr><tr><td>Photoflo-200² ;</td><td>EMS</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>Bromhydrate de poly-L-lysine (polylysine)</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage de sonde</td><td>Instruments moléculaires</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td><td>Qiagen</td><td>28306</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>7003, réactif</td><td></td>de décontamination</tr><tr><td>sans RNase1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>S2 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>Joints en silicone&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>P24743</td><td></td></tr><tr><td>Tdc2_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE880</td><td></td></tr><tr><td>Tk_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR484</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 10 % SDS</td><td>Thermofisher</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure BSA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à cheveux non conjuguées et Alexa Fluor</td><td>Instruments</td> <td>moléculaires</td><td></td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</tr><tr><td>VAChT_B1</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTA904</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTB212</td><td></td></tr><tr><td>Zeis Z7 Gel Holder&nbsp ;</td><td>Janelia&nbsp ;</td><td>Fichiers CAO disponibles sur demande</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal inversé Zeiss LSM 980 Microscope à</td> feuille de lumière <td>Zeiss</td><td>https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z7 Microscope à feuille de lumière</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</td><td></td></tr></tbody></table>

détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

La compréhension de l’expression des gènes est essentielle pour déchiffrer les fonctions cellulaires. Cependant, les méthodes d’analyse de l’expression de nombreux gènes in situ au sein d’un tissu donné restent limitées. Le protocole EASI-FISH décrit ici a été adapté pour détecter l’expression de dizaines de gènes dans le système nerveux central (SNC) intact de la drosophile adulte à l’aide de réactifs disponibles dans le commerce. Ce protocole comprend une nouvelle formulation de gel qui améliore la robustesse du gel, permettant plusieurs cycles d’hybridation et permettant l’intégration de plusieurs cerveaux par gel. Cette amélioration augmente le débit, facilite la comparaison optimale des conditions expérimentales et réduit les coûts de réactifs. De plus, en utilisant le système GAL4-UAS pour la co-détection de la protéine fluorescente verte (GFP), l’expression génique peut être visualisée dans des types spécifiques de cellules neuronales ou gliales. Notamment, la haute résolution obtenue par la microscopie à expansion, combinée à la sensibilité de la méthode, permet de détecter des transcrits d’ARN uniques. Cette approche intègre efficacement une qualité d’image élevée avec un débit élevé, ce qui en fait un outil puissant pour étudier l’expression des gènes dans le cerveau intact de la mouche.

Les performances de ce protocole EASI-FISH modifié sont illustrées par la détection de l'expression de plusieurs gènes différents associés à des neurotransmetteurs et à des neuropeptides dans l'encéphale adulte de Drosophila, sur plusieurs cycles. Typiquement, les cerveaux gélifiés et agrandis ont été hybridés avec deux ou trois sondes par cycle, suivis d'une amplification HCR à l'aide de paires de brins en épingle à cheveux conjugués à l'Alexa Fluor (AF) 488 (sauf si la GFP était exprimée), à l'AF546, à l'AF647...

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

multiplex-detection-gene-expression-intact-drosophila-brain-using

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Cette vidéo démontre la coloration par immunofluorescence d’un cerveau de drosophile transgénique pour l’imagerie unicellulaire des cellules gliales. Le cerveau exprime des protéines ciblées sur la membrane fusionnées avec différentes combinaisons d’épitopes antigéniques sous le contrôle d’un système de recombinase gliale spécifique. Les cerveaux isolés et fixes sont colorés avec des anticorps primaires spécifiques aux épitopes antigéniques, suivis d’anticorps secondaires conjugués aux...

Coloration par immunofluorescence du cerveau de la drosophile pour l’imagerie unicellulaire des cellules gliales

Source : Jolly, S., et.al. Combinaison de l’hybridation in situ à double fluorescence  avec immunomarquage pour la détection de l’expression de trois gènes dans des sections de cerveau de souris. J. Vis. Exp. (2016). Cette vidéo démontre l’utilisation de l’hybridation in situ à double fluorescence pour visualiser l’expression de deux cibles d’ARN dans des coupes de cerveau de souris. Le protocole implique une détection séquentielle de l’ARN à l’aide de sondes marquées à la fluorescéine, à...

 Réalisation d’une hybridation in situ à double fluorescence pour détecter l’expression génique dans des sections de cerveau de souris

Nous décrivons ici un ensemble de montage...

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Nous décrivons un montage entier hybridation in situ (MC-WISH) procédure chromogène multi-cible dans embryons de drosophile intactes permettant la détection simultanée et spécifique de trois modes de distribution de l'ARNm différents en comparant précipités de couleur.

Multi-cible chromogénique totalité montage<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation pour la comparaison des gènes domaines d&#39;expression dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

La localisation de l’expression génique sur des types de cellules spécifiques peut être difficile en raison de l’absence d’anticorps spécifiques. Nous décrivons ici un protocole de triple détection simultanée de l’expression génique en combinant l’hybridation in situ d’ARN à double fluorescence avec l’immunomarquage.

Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

Les cellules affichent différentes morphologies et établissent une variété d’interactions avec leurs voisins. Ce protocole décrit comment révéler la morphologie des cellules individuelles et d’étudier les interactions cellule-cellule en utilisant le système d’expression de Gal4/UAS bien établi.

Application de MultiColor FlpOut Technique pour étudier les Morphologies de cellule unique de haute résolution et Interactions cellulaires des cellules gliales chez la drosophile

Le protocole d’ARN décrit in situ hybridation permet la détection de l’ARN dans des embryons de drosophile entiers ou tissus disséqués. À l’aide de microplaques 96 puits et amplification de signal tyramide, transcriptions peuvent être détectées à un débit, sensibilité et haute résolution et à un coût relativement faible.

Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour réaliser l’hybridation par réaction en chaîne fluorescente in situ (HCR-FISH) dans les lobes optiques larvaires de Drosophila melanogaster . Les procédures de conception de la sonde, de l’hybridation, de l’amplification et du montage tissulaire sont détaillées afin de faciliter la visualisation du lobe optique en développement.

FISH à réaction en chaîne d’hybridation dans le lobe optique en développement de Drosophila

Une démonstration de la fabrication et l'utilisation d'une électrode extracellulaire aspiration utilisés pour mesurer des enregistrements électrophysiologiques des cordons de rongeur néonatal...

La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Découvrez la technique EASI-FISH pour visualiser l'expression génique multiplex dans le cerveau intact de Drosophila. Cette méthode combine microscopie d'expansion et hybridation in situ par fluorescence itérative.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (Vidéo) | JoVE Journal

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Explorer plus de vidéos