Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion
May 2nd, 2025
L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.
Nous avons développé un protocole robuste où plusieurs cycles d’hybridation in situ peuvent être effectués sur le même cerveau de drosophile, permettant de visualiser les modèles d’expression de nombreux gènes différents. L’intégration du cerveau de la mouche dans un hydrogel garantit une excellente intégrité tissulaire et une stabilité de l’ARNm sur plusieurs cycles d’hybridation. Il améliore également considérablement la clarté optique lors de l’imagerie.
EASI-FISH peut être adopté par n’importe quel laboratoire avec un microscope confocal ou à feuillet de lumière pour définir les profils d’expression génique des types de cellules dans le cerveau de la mouche. Pour commencer, essuyez une lame non chargée avec un réactif de décontamination à l’ARN. Retirez le film opaque protégeant l’adhésif du joint en silicone.
Collez ensuite le joint contenant jusqu’à quatre chambres sur la glissière. À l’aide d’une pipette P20, enduire chaque surface de chambre d’un microlitre de polylysine. Ensuite, transférez jusqu’à quatre cerveaux de drosophile par tube dans un tube PCR de 0,2 millilitre.
Réhydratez les cerveaux dans 150 microlitres de PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 suivi de PBS. Ajoutez 40 microlitres de PBS dans chaque chambre. À l’aide d’une pince à épiler fine, positionnez doucement les cerveaux en rangée au centre de la chambre, en laissant un peu d’espace entre eux.
Retirez le PBS de la chambre et ajoutez immédiatement 50 microlitres de tampon MOPS de 20 millimolaires. Pendant que les cerveaux s’équilibrent dans le tampon MOPS, pipetez des volumes égaux de Melphalan-X décongelé dans un tube avec un tampon MOPS de volume égal. Ajoutez ensuite la solution mère Ac-X dans un rapport de un à 100.
Vortex la solution et faites-la tourner brièvement pour la récupérer. Retirez tout le tampon MOPS des chambres et ajoutez 50 microlitres de la solution Melphalan-X Ac-X. Placez une lamelle sur le dessus de chaque chambre sans utiliser l’adhésif du joint pour l’étanchéité.
Placez ensuite la chambre dans une boîte humidifiée. Le lendemain, retirez délicatement la lamelle et aspirez la solution Melphalan-X Ac-X. Lavez les cerveaux montés deux fois dans 100 microlitres de PBT à 0,1 %, suivis de 100 microlitres de PBS.
Placez les solutions décongelées de TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, de TEMED et de persulfate d’ammonium sur de la glace. Vortex la solution TREx-1000 pour s’assurer qu’il n’y a pas de précipité. Mélangez les solutions pour préparer une solution de gel et vortex avant de glacer.
À l’aide d’une pointe de pipette, retirez le PBS de la chambre et évacuez tout liquide résiduel avec une lingette non pelucheuse. Ajoutez immédiatement 40 microlitres de solution de gel sur les cerveaux de chaque chambre. Incuber les chambres à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Retirez maintenant la solution de gel de la chambre. Ensuite, décollez le film protecteur transparent de l’adhésif de surface du joint. Ajoutez 45 microlitres de solution de gel frais.
Placez délicatement une lamelle sur la chambre et appuyez dessus pour sceller la chambre avant de l’incuber à quatre degrés Celsius pendant encore 10 minutes. Incuber la chambre à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure pour polymériser le gel. Après avoir refroidi les gels sur un banc, utilisez une lame de rasoir pour retirer soigneusement la lamelle de recouvrement et le joint en silicone.
Coupez le gel en une forme rectangulaire et coupez le coin supérieur droit pour indiquer l’orientation de l’échantillon. Ensuite, utilisez un pinceau fin imbibé d’une petite quantité de tampon Pro K pour retirer délicatement les gels de la lame. Transférez chaque gel individuellement dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres.
Mélangez 500 microlitres de tampon Pro K et cinq microlitres d’enzyme Protéinase K, et ajoutez le mélange à chaque gel. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, retirez le tampon à l’aide d’une pipette fine et flexible, puis lavez les gels trois fois dans du PBS pendant 10 minutes chacun.
Incuber les gels pendant 30 minutes dans un millilitre de tampon DNASE1 à 37 degrés Celsius. Mélangez 50 microlitres d’enzyme DNASE1 avec 450 microlitres de tampon DNASE1. Mélangez doucement sans vortex.
Incuber chaque gel dans 500 microlitres de solution DNASE1 pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les gels quatre fois pendant 15 minutes avec un millilitre de PBS à température ambiante. Maintenant, incubez les gels dans 500 microlitres de tampon d’hybridation décongelé sans sondes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Diluer les sondes dans le tampon d’hybridation dans un rapport de un à 100, en préparant 300 microlitres par gel. Incuber les gels avec un tampon d’hybridation contenant des sondes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, lavez d’abord les gels dans un tampon de lavage de sonde, puis dans du PBS.
Pour la réaction en chaîne d’hybridation, ajoutez 500 microlitres de tampon d’amplification au gel et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Chauffez les épingles à cheveux fluorescentes à 95 degrés Celsius pendant 90 secondes dans un appareil PCR et refroidissez la solution à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour chaque sonde, diluez les paires d’épingles à cheveux correspondantes dans un rapport de un à 50 dans le tampon d’amplification, en préparant 300 microlitres par gel.
Après avoir vortex le mélange, ajoutez le mélange aux gels et incuber. Pour monter le gel pour l’imagerie en feuille légère, enduisez deux fois la surface de fixation du gel d’un porte-gel avec un microlitre de polylysine, en le laissant sécher à 37 degrés Celsius entre les couches. Ensuite, placez le gel sur une lamelle de protection de manière à ce que la coupe soit sur le côté gauche.
À l’aide d’un pinceau, transférez le gel sur la surface traitée en un seul mouvement. Les gènes associés aux neurotransmetteurs et les gènes neuropeptides présentaient des profils d’expression distincts dans le cerveau de la drosophile adulte. VGluT et Gad1 ont été codétectés dans le même cycle d’hybridation, montrant des profils d’expression ne se chevauchant pas.
AstA a montré une forte expression dans le lobe optique et une expression plus faible dans le complexe central. Crz était fortement exprimé dans la pars lateralis, tandis que des niveaux d’expression plus faibles ont été observés dans les neurones du lobe optique. Tk a été détecté dans les neurones H delta D identifiés avec l’expression de Mer-GFP à l’aide d’une ligne GAL4 scindée spécifique par microscopie à feuillet de lumière ou confocale.
FMRFamide était absent dans les neurones PFG marqués par Mer-GFP, mais détecté dans les neurones environnants. L’imagerie à haute résolution des neurones FB4K a confirmé la distribution spatiale des transcrits VGluT et ChAT/VAChT. Les neuropeptides, tels que AstA et Crz, sont si fortement exprimés dans certaines cellules que les points fluorescents individuels représentant des transcrits uniques ne peuvent plus être séparés.
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Aperçu
Cet article présente l'hybridation in situ par fluorescence assistée par expansion (EASI-FISH), une nouvelle technique qui intègre la microscopie d'expansion avec l'hybridation in situ par fluorescence pour observer l'expression des gènes dans des tissus épais. La méthode est adaptée au système nerveux central de Drosophila, permettant aux chercheurs de visualiser les patrons d'expression de multiples gènes à travers divers types cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine de science
- Neurosciences
- Expression génique
- Biologie cellulaire
Contexte
- La microscopie d'expansion permet une meilleure clarté optique et résolution dans l'imagerie des tissus épais.
- L'hybridation in situ par fluorescence est une méthode puissante pour détecter l'expression des gènes.
- La combinaison de ces techniques améliore la capacité d'analyser l'architecture tissulaire complexe chez les organismes modèles.
- Drosophila sert de modèle précieux pour comprendre le développement neural et la fonction des gènes.
Objectif de l'étude
- Détailler un protocole robuste facilitant plusieurs séries d'hybridation in situ de l'ARN.
- Permettre une visualisation complète de l'expression des gènes dans le cerveau de Drosophila.
- Fournir un cadre facilement adoptable par divers laboratoires équipés d'outils de microscopie de base.
Méthodes utilisées
- L'étude utilise une technique d'inclusion dans un hydrogel pour préserver l'intégrité des tissus dans les cerveaux de Drosophila.
- Le modèle biologique clé inclut le système nerveux central intact de Drosophila, se concentrant sur diverses expressions géniques neuronales.
- Aucun flux de travail multiomique n'est mentionné dans l'article.
- Des protocoles détaillés pour le traitement des tissus, l'hybridation et l'imagerie sont inclus.
- Les résultats sont validés par des analyses d'expression spatiale comparatives utilisant la microscopie confocale ou à lame lumineuse.
Résultats principaux
- Des patrons d'expression distincts pour les gènes associés aux neurotransmetteurs et aux neuropeptides ont été observés dans les cerveaux de Drosophila.
- Parmi les exemples de résultats, on trouve une expression non chevauchante de VGluT et Gad1, suggérant des rôles divergents dans la neurotransmission.
- Des neuropeptides comme AstA et Crz ont démontré des niveaux élevés d'expression dans des régions neurales spécifiques, en corrélation avec des implications fonctionnelles.
- Cette méthode permet une cartographie précise de l'expression des gènes à travers les couches cellulaires et contribue à la compréhension des relations structure-fonction neuronales.
Conclusions
- L'EASI-FISH représente une avancée significative dans la visualisation de l'expression des gènes dans les tissus complexes.
- L'étude souligne l'utilisation complémentaire de différentes techniques d'imagerie pour fournir des aperçus sur la fonction des gènes neuronaux.
- Les implications s'étendent à l'amélioration de la compréhension des mécanismes neuronaux, avec des applications potentielles en biologie du développement et en neurogénétique.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Multiplexed gene expression mapping in intact neural tissue is a critical capability for early discovery and target validation in neurobiology-focused drug development. The EASI-FISH protocol enables high-throughput, high-resolution detection of dozens of transcripts in the Drosophila brain, supporting robust comparative analyses and reducing reagent costs. This approach enhances predictive confidence in cell-type specific gene expression, informing mechanistic de-risking and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of gene expression patterns across neuronal and glial subtypes.
- Supports functional target validation by visualizing spatial transcript distribution at single-molecule resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing multiplexed detection in disease-relevant neural circuits.
- Improves predictive confidence for target selection and prioritization in neurogenetics pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed tissue systems for downstream screening and phenotypic assays.
- Standardizes assay conditions by embedding multiple brains per gel, enabling direct comparison of experimental variables.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of gene expression for reliable compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse through robust gel formulation and iterative hybridization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression mapping with translational biomarker discovery in neural tissue models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling high-throughput, cell-type specific analyses.
- Reduces biological risk in advancing neuroactive compounds by clarifying target engagement in complex tissue contexts.
Pipeline & Workflow Integration
EASI-FISH integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and translational research in neurobiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping multiplexed gene expression in situ.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible tissue systems for quantitative evaluation of gene modulation.
- Analytics: Enables single-transcript resolution and spatial quantification for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by aligning gene expression data with disease-relevant neural circuits.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for multiplexed gene expression analysis across diverse neurobiological models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in gene expression workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal or light sheet microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to robust imaging infrastructure and commercially available reagents.
- Demands cross-team standardization for gel preparation and hybridization protocols.
- Adaptable to other model systems with optimization of gel and probe conditions.
- Throughput and multiplexing are limited by imaging capacity and probe design constraints.
