Méthodologie améliorée pour l’administration de liquide dans le poumon de souris : intubation à l’aide d’un otoscope grand public

[Narrateur] Amélioration de la méthodologie d’administration du liquide dans le poumon de la souris. Intubation à l’aide d’un otoscope grand public. Toutes les procédures animales et ce contenu ont été examinés par le département de médecine comparée de l’Université de Tulane et sont approuvés selon le protocole 1810. Demandez l’approbation de l’IACUC et consultez le personnel vétérinaire de votre établissement avant de continuer. La mise au point de nouvelles thérapies pulmonaires dépend d’une administration fiable et reproductible dans le poumon de la souris, mais elle repose traditionnellement sur l’administration intranasale, l’aspiration oropharyngée par langue pleine ou l’incision chirurgicale. La méthode suivante a réduit la variabilité par rapport à la langue pleine, ce qui permet d’obtenir des cohortes d’animaux plus petites. Il est également beaucoup moins invasif que l’abattage. Procédure, première étape, configuration. Le kit d’intubation pour rongeurs initialement utilisé est équipé de cales de sécurité pour l’intubation. Il s’agit de petits manchons coniques qui s’adaptent sur un cathéter flexible de calibre 20 et d’un pouce. Ils empêchent le cathéter d’endommager la carène. Nettoyez une cale de sécurité avec un tampon de préparation à l’isopropanol avant de l’utiliser. Faites glisser la cale de sécurité propre, verte ici, sur la canule flexible de calibre 20. Rassemblez les autres outils nécessaires, y compris un otoscope commercial, un téléphone portable, un support de souris avec cône de nez, des pinces courbées et finement dentelées, le tube endotrachéal et la lumière à fibre optique, le cas échéant. Nettoyez tous ces éléments avec un tampon de préparation à l’isopropanol avant utilisation. Prenez une longueur d’environ 20 centimètres de tube flexible. Pliez-le en forme de U et ajoutez une connexion de verrouillage de leurre à une extrémité. Fixez la forme en U avec une attache torsadée. Ajoutez deux à 300 microlitres d’eau filtrée stérile ou d’encre de Chine dans le tube. Ci-après, cet assemblage est appelé tube à bulles. Prenez une boucle de suture en attachant 13 centimètres de suture en soie de taille zéro dans un cercle. Placez cette boucle en haut du support de souris et assurez-vous que les deux côtés de la suture sont bien fixés. Placez le support de souris sur la base de la loupe en métal. Positionnez les mains serviables autour de l’endroit où se trouvera la bouche de la souris. Placez une souris dans la chambre d’induction. Utilisez de l’oxygène à débit constant à 0,8 litre par minute et 2 % d’isoflurane. Anesthésie suffisamment la souris pour ne pas se réveiller lors de la mise en place du cône nasal. Ne supprimez pas de manière significative la fréquence respiratoire de la souris. Des respirations régulières aident à apprécier les cordes vocales. Connectez l’otoscope au téléphone portable et assurez-vous que le flux vidéo est stable. Attention, pour minimiser l’exposition du chercheur à l’isofluorane lors de cette procédure, utilisez un respirateur chimique si vous effectuez plusieurs intubations ou si vous vous entraînez à cette méthode. Alternativement, effectuez la procédure dans quelques bois. Deuxième étape, mise en scène des animaux. Sortez le premier animal de la chambre d’induction dès qu’il est endormi. Ébouriffez-les et placez leurs dents supérieures sur la longueur de la suture. Appliquez une légère tension sur l’animal pour maintenir le positionnement de la suture tout en reposant la souris sur le support. Ajustez légèrement l’angle du cou vers l’arrière, en plaçant le cou en extension mineure de cinq à 15 degrés. Poussez doucement le cône nasal sur les narines. N’enfoncez pas fermement le cône nasal car il pourrait interférer avec la suture qui suspend la souris. À l’aide d’une grande pince courbée finement dentée, saisissez fermement la langue aussi près que possible de la lèvre inférieure. Tirez-le fermement vers le bas et loin des dents supérieures et sur le côté des dents inférieures. La prudence, une traction prolongée, une tension excessive ou l’écrasement de la langue peuvent compromettre la santé de l’animal. Veuillez surveiller les signes de traumatisme, notamment les ecchymoses, les saignements, l’enflure ou la dessiccation de la langue. Si vous en observez, interrompez la procédure et alertez le personnel vétérinaire. Si vous utilisez des mains secourables, soutenez les pinces dans cette position. Alimentez la lumière à fibre optique si vous l’utilisez à travers le cathéter flexible avec le coin de sécurité d’intubation en place. Troisième étape, appréciation visuelle des cordes vocales et intubation. Avec l’otoscope dans votre main non dominante, appuyez légèrement sur la langue. Inclinez ensuite la caméra et sa source lumineuse pour visualiser les cordes vocales près de la base de la langue. En raison de légères variations dans l’anatomie et la couleur des tissus, utilisez le mouvement associé à la respiration pour confirmer l’identification structurelle. Au début, s’orienter dans le flux vidéo peut s’avérer difficile. Ce sont les faux plis vocaux. Ce sont les vraies cordes vocales. Il s’agit d’une réflexion sur le tissu buccal. Il s’agit de la sonde et de la lumière à fibre optique. C’est l’épiglotte. C’est le palais mou. Il s’agit de la rima glottidis, votre cible pour l’intubation. C’est la lèvre de l’otoscope, qui enfonce la langue. C’est la région interdite. Avec la lumière à fibre optique allumée, si vous l’utilisez, alimentez la canule le long de l’otoscope, en établissant un léger contact avec la base de la langue ou la partie labisale de l’otoscope. À titre de référence, ajustez l’angle d’approche du cathéter pour qu’il soit très peu profond. Immédiatement après avoir inséré le cathéter, à moins d’un millimètre au-delà des cordes vocales, soulevez l’extrémité du cathéter de manière à ce qu’elle soit presque parallèle au plan de travail. Cela empêche l’épiglotte de forcer le cathéter dorsalement dans l’œsophage. Notez qu’il ne devrait y avoir presque aucune résistance lors de l’avancement du cathéter. Si vous rencontrez une résistance, retirez immédiatement le cathéter et laissez les respirations revenir à la normale. Si des saignements sont observés, consulter le personnel vétérinaire. Quatrième étape, confirmation de la mise en place de la sonde endotrachéale. En plus de la confirmation visuelle que le tube est au bon endroit à l’aide de l’otoscope, la trachée offre moins de résistance lors de la mise en place que l’œsophage. La profondeur d’insertion optique est d’environ cinq millimètres au-delà des cordes vocales. La lumière peut être vue à travers le cou comme méthode secondaire pour confirmer que la profondeur d’insertion est appropriée. Remarque : le coin de sécurité pour l’intubation doit empêcher une profondeur excessive dans le placement de la sonde endotrachéale. La cale de sécurité empêchera les traumatismes à la corina, mais elle n’a pas besoin d’empêcher l’avancement. Ensuite, tout en maintenant le tube endotrachéal en place, retirez la lumière à fibre optique. Confirmez que le cathéter est bien placé à l’aide de la méthode du tube à bulles. Fixez le tube à bulles en place à l’aide du verrou inférieur. Le volume courant doit être immédiatement apparent. Sinon, la sonde endotrachéale est mal placée. Retirez-le rapidement et laissez la fréquence respiratoire normale de la souris revenir. Cinquième étape, l’administration intratrachéale. Tout comme la méthode de traction de la langue pour l’accouchement oropharyngé, l’accouchement par intubation risque de noyer l’animal. Chez les souris adolescentes et adultes, 50 microlitres est un volume de liquide généralement sûr à délivrer et est suffisant pour se répandre dans tous les poumons. Si vous utilisez une pipette pour l’administration, pipetez le volume souhaité directement dans le cathéter et laissez la souris inhaler la solution. Pour assurer une administration diffuse vers les poumons, ainsi que le liquide délivré dans les poumons avec jusqu’à 500 microlitres d’air. Si vous le souhaitez, plusieurs dépressions du pipeteur peuvent être effectuées sans risquer une aspiration négative du liquide délivré. Notez que l’utilisation d’un volume courant supérieur à 200 microlitres peut être nécessaire lors du rinçage de l’inoculum à l’air. Cependant, l’utilisation de 500 microlitres ne risque pas de traumatisme car il ne s’agit que d’environ la moitié de la capacité vitale. Sixième étape, évaluation de la prestation. Une lampe à fibre optique portable peut être fabriquée à partir de composants peu coûteux et faciles à obtenir. Un ensemble commercial de fibre optique, comme illustré ici, peut être utilisé. Cependant, un couvercle en tube conique de 50 ml avec un trou percé à l’aide d’une aiguille de calibre 20 à travers laquelle un câble à fibre optique en plastique de 75 millimètres est introduit suffit. Des appareils commerciaux et faits à la main ont été utilisés dans cette vidéo. Résultats représentatifs, l’administration intratrachéale par intubation entraîne une amélioration de l’administration et une réduction de la variabilité par rapport à l’aspiration oropharyngée par traction de la langue. Comparaison directe de l’extraction de la langue et de l’intubation guidée. Trois chercheurs différents avec des niveaux d’expérience enfouis ou à qui l’on a demandé d’administrer indépendamment 50 microlitres d’encre de Chine diluée par voie oropharyngée par traction de la langue à des souris C57 BL/6J âgées de 10 à 12 semaines des deux sexes. Deux chercheurs ont également délivré le même stock et le même volume d’encre dans les poumons par intubation, comme décrit. Les poumons ont été retirés peu de temps après l’accouchement et photographiés sous un grossissement de 2x. Les photographies ont été évaluées pour la zone colorée par un chercheur indépendant en aveugle à l’aide de l’image J. Elle a constaté qu’une plus grande partie de la zone pulmonaire était colorée si l’intubation était utilisée. De plus, la variabilité, exprimée en pourcentage d’écart par rapport à la moyenne, était réduite si l’on utilisait l’administration intratrachéale après l’intubation plutôt que l’extraction de la langue. Cette station utilisée pour l’intubation guidée est préparée comme indiqué. De gauche à droite, pipettes pour l’administration, tube à bulles pour la confirmation de la mise en place appropriée de la sonde endotrachéale, pinces, spatule, spéculum nasal pédiatrique, mains secourables, lumière grossissante, support de souris avec cône nasal, sonde à fibre optique et chambre d’induction d’anesthésie. L’intubation permet une plus grande distribution dans les poumons avec moins de variabilité par rapport à l’aspiration des OP. Des souris femelles de 10 semaines ont reçu une dose de 10 à 11e VG de luciférase AIV 6.2 et ont été évaluées à l’aide d’une imagerie bioluminescente in vivo sept jours plus tard. 10 minutes avant l’imagerie, ils ont reçu une injection sous-cutanée de luciférine. Des images représentatives de souris recevant de la luciférase AV 6.2 par aspiration OP après une traction de la langue ou une installation intratrachéale par intubation sont présentées. L’aspiration oropharyngée par traction de la langue a conduit à la distribution du signal dans diverses parties des voies respiratoires supérieures, tandis que l’intubation a conduit à un signal concentré dans les poumons. Les régions d’intérêt sont de la même zone, et la luminance moyenne à l’intérieur de la région est indiquée sur l’image. La quantification des signaux de la luciférase a révélé une amélioration de l’efficacité de l’administration dans les poumons par intubation et a mis en évidence la réduction de la variabilité de l’administration à l’aide de cette méthode. Conclusion, comme le montrent les figures précédentes, l’inoculation interpulmonaire à l’aide de la méthode traditionnelle de traction de la langue montre une distribution inégale et incohérente de l’inoculum et une plus grande variabilité dans la quantité atteignant les poumons. En revanche, la méthode d’intubation a permis une administration plus cohérente dans les poumons droit et gauche et était moins variable. Les résultats positifs solidement démontrés de cette méthode d’intubation sont, d’une part, l’installation reproductible de jusqu’à 50 microlitres dans les poumons de la souris, d’autre part, la distribution diffuse du liquide instillé dans tous les poumons et troisièmement, la réduction de la propagation de l’inoculum au-delà des poumons. Cette méthode est rapide, sûre et peut être intégrée aux procédures de laboratoire sans équipement coûteux ni formation chronophage.