Séparation et fractionnement de protéines de paroi cellulaire et de membrane cellulaire de Mycobacterium tuberculosis pour l’analyse des protéines en aval

Notre recherche s’est concentrée sur le développement d’une méthode rationalisée pour séparer les protéines insolubles de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire de Mycobacterium tuberculosis en fractions simples pour des tests protéomiques et immunologiques directs. Les progrès des techniques électrophorétiques permettent désormais de séparer les protéines complexes en moins de fractions protéiques, ce qui facilite l’isolement efficace basé sur les spécifications de masse pour des applications fonctionnelles, protéomiques et immunologiques. Les principaux défis comprennent la faible solubilité de la protéine hydrophobe précipitant au-dessus de cent milligrammes et la dénaturation induite par le SDS-PAGE, qui entrave l’application en aval nécessitant une confirmation native comme les tests d’activité enzymatique.

Aucun protocole actuel ne sépare systématiquement les protéines hydrophobes insolubles de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire en fractions hydrosolubles définies pour une analyse protéomique et immunologique directe, ce qui est essentiel pour comprendre la fonction et guider les interventions. Nos recherches futures se concentreront sur le développement de diagnostics basés sur l’antigène des lymphocytes T et sur l’évaluation de leur sensibilité, de leur spécificité et de leur performance dans la population tuberculeuse pour une détection précoce et précise de la tuberculose dans le but de favoriser un meilleur contrôle de la maladie. Pour commencer, obtenez des échantillons de paroi cellulaire, de membrane cellulaire et de protéines cytosoliques à partir de lysat de cellules entières de bacilles de Mycobacterium tuberculosis.

Solubiliser les protéines de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire dans un tampon de focalisation isoélectrique. Ajoutez 2 % d’ampholytes entre les plages de pH de 3 à 10 et de 4 à 6 dans un rapport de un à quatre. Maintenant, fractionnez les protéines solubilisées dans un système de focalisation isoélectrique liquide maintenu à quatre degrés Celsius avec un bain d’eau de refroidissement.

Effectuez une séparation de mise au point isoélectrique en suivant les instructions du fabricant en appliquant une puissance constante de 12 watts. Collectez les fractions individuelles de focalisation isoélectrique à l’aide d’une pompe à vide. Déterminez les valeurs de pH de chaque fraction.

Soumettez 50 microgrammes des fractions séparées à SDS-PAGE et visualisez les protéines à l’aide de la coloration Coomassie Brilliant Blue ou argent. Commencez par mélanger les fractions de la paroi cellulaire et de la membrane cellulaire séparées par l’IEF avec le tampon d’échantillon d’électrophorèse sur gel SDS. Chauffez le mélange à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Séparez les fractions protéiques dans la deuxième dimension, à l’aide de gels de polyacrylamide de 16 x 20 centimètres avec un gel de résolution de 12,5 % et un gel d’empilement de 4 %. Ensuite, utilisez un seul puits d’échantillon de 13 centimètres de long pour charger l’échantillon sur le gel. Effectuez une électrophorèse à un courant constant de 50 milliampères par gel jusqu’à ce que le front du colorant atteigne le bas du gel.

Après l’électrophorèse, équilibrez le gel dans le tampon d’élution pendant 10 minutes. Transférez le gel dans un appareil d’élution de gel entier selon les instructions du fabricant de l’instrument. Faites fonctionner l’éluateur à un courant constant de 250 milliampères pendant une heure pour éluer les protéines du gel, puis utilisez une pompe à vide pour collecter environ 30 fractions de protéines, chacune mesurant trois millilitres, du gel.

Quantifier la concentration en protéines dans les fractions éluées à l’aide du dosage des protéines de l’acide bicinchoninique. Soumettre 10 microgrammes des fractions de protéines éluées à l’analyse SDS-PAGE et visualiser les bandes par coloration au bleu brillant de Coomassie. Des modèles distincts de bandes protéiques ont été observés dans les premières fractions surnageante :paroi cellulaire, membrane cellulaire et cytosol de Mycobacterium tuberculosis, confirmant le fractionnement subcellulaire réussi.

La focalisation isoélectrique des protéines de la paroi cellulaire a montré la plus forte concentration de protéines dans les fractions dont le pH est inférieur à 2,5. SDS-PAGE des fractions IEF de la paroi cellulaire a révélé des bandes protéiques distinctes, principalement dans les fractions 1 à 8. La séparation des protéines de la membrane cellulaire par IEF a révélé des pics de concentration de protéines majeurs entre pH 4 et pH 10, la concentration la plus élevée se produisant autour de pH 10.

SDS-PAGE des fractions IEF de la membrane cellulaire a montré des profils protéiques variés avec des bandes plus claires dans les fractions 1 à 9. La séparation préparative SDS-PAGE des protéines de la paroi cellulaire résolues par l’IEF a produit des fractions principalement inférieures à 100 microgrammes par millilitre. SDS-PAGE des fractions de protéines de la paroi cellulaire éluées a montré une large gamme de poids moléculaires de protéines, avec des bandes plus concentrées dans les fractions 6 à 10.

Le SDS-PAGE préparatif des fractions de protéines de la membrane cellulaire a révélé que plus de la moitié des fractions avaient des concentrations de protéines comprises entre 50 et 199 microgrammes par millilitre. SDS-PAGE des fractions de protéines membranaires cellulaires éluées a révélé des bandes concentrées dans les voies 1 à 8 et 13 à 16.