Agencement spatialement compact de coupes de larves de poisson-zèbre pour l’analyse transcriptomique spatiale

Dans le laboratoire Morhardt, nous utilisons le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le développement et la fonction de la vessie. Nous avons identifié une vessie urinaire fonctionnelle qui se remplit et se vide chez le poisson-zèbre. Bien que le poisson-zèbre soit petit, nous avons cherché à tirer parti de sa taille pour utiliser économiquement les techniques de transcriptomique spatiale et notre compréhension de la vessie des vertébrés.

Les techniques de transcriptomique spatiale peuvent rapidement devenir coûteuses si les réactifs et les équipements ne sont pas optimisés. Ce protocole fournit une technique éprouvée pour y parvenir en utilisant le poisson-zèbre et fournit des informations sur les résultats attendus et l’atténuation des problèmes qui peuvent survenir à la suite de la technologie. Outre l’utilisation économique de technologies transcriptomiques spatiales coûteuses, ces travaux nous ont permis d’effectuer des analyses transcriptomiques spatiales à grande échelle d’organes essentiellement entiers sur plusieurs âges tout en minimisant les effets de lot.

Pour commencer, refroidissez le cryostat à 22 degrés Celsius et rassemblez tous les objets nécessaires. Préparez un moule en plastique jetable pour l’alignement de l’échantillon. Placez un morceau de ruban adhésif de laboratoire à l’intérieur du moule de base et tracez une ligne droite à travers celui-ci avec un marqueur permanent comme point de référence.

Marquez l’intérieur du moule de base pour assurer une bonne orientation de l’échantillon pendant la cryosection. Après avoir amorcé la buse de la bouteille de fluide de congélation, versez la quantité nécessaire dans un coin du moule de base. Inclinez lentement le moule de base pour répartir uniformément le fluide.

Maintenant, placez le moule de base avec du fluide de congélation dans un bain de glace et incubez-le pendant au moins 10 minutes pour refroidir le milieu. Ensuite, ajoutez une partie d’éthanol à 100 % à une partie de glace sèche dans un seau à glace sous la hotte. Placez le plat ou le bateau en aluminium jetable dans le bain de glace et couvrez le seau pendant cinq à 10 minutes.

Récupérez les poissons euthanasiés après les avoir immergés dans de l’eau à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. À l’aide d’une pince à pointe fine, saisissez la nageoire caudale pour retirer le poisson et pressez-la doucement contre une lingette absorbante non pelucheuse pour le sécher. Placez le moule de base préparé sous un microscope stéréoscopique avec un grossissement de 10x.

Positionnez l’échantillon dans le moule le long du point de référence dans la bonne orientation. Couvrez délicatement l’échantillon d’une autre fine couche de produit de congélation. Utilisez un point de référence anatomique pour aligner précisément le poisson sur les lignes marquées à l’intérieur du moule de base et ajustez l’orientation à l’aide d’une pince à pointe fine, en évitant les bulles.

Appliquez un morceau de glace sèche au fond du moule de base sous l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit localement gelé en position. Maintenez un plan horizontal de niveau pour éviter tout désalignement de l’échantillon avant de le congeler complètement. Placez maintenant le moule de base avec l’échantillon sur le bateau ou le plat en aluminium dans le bain de glace sèche et d’éthanol.

Assurez-vous que le bateau reste flottant à la surface et que le moule de base reste sec. Couvrez le bain et laissez les échantillons geler pendant 10 minutes. Ensuite, enveloppez le moule de base congelé dans du papier d’aluminium et conservez-le dans un congélateur à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à être sectionné.

Apportez le moule de base congelé dans le cryostat pré-refroidi pour la cryosection et placez-le dans la chambre du cryostat. Après avoir retiré la lame d’imagerie spatiale de son stockage, placez-la dans un support de lame pré-réfrigéré. Rangez le support de diapositive avec la lame d’imagerie spatiale dans la chambre du cryostat à 22 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour le prélèvement de la section.

Maintenant, retirez l’échantillon congelé du moule de base et placez-le dans un mandrin avec un produit de congélation frais, en vous assurant que la surface de coupe fait face à la lame du microtome. Placez ensuite une fine lame de microtome fraîche dans le cryostat. Après avoir aligné le moule sur la lame, coupez la région d’intérêt avec une épaisseur recommandée de 20 à 50 micromètres.

Assurez-vous que les marquages à l’intérieur du moule sont transférés sur le bloc congelé pour une orientation correcte de l’échantillon. Ajustez le moule pendant la coupe de manière à ce que la surface de coupe reste parallèle aux repères de référence dans le produit de congélation. Coupez des sections du bloc congelé et rassemblez-les sur une lame de microscope standard chargée positivement.

Vérifiez les sections au microscope à fond clair pour confirmer que le rognage est terminé. Retirez ensuite la lame d’imagerie spatiale de la chambre du cryostat et placez-la dans un bain de glace à quatre degrés Celsius, tout en la maintenant à l’intérieur du support de lame. Commencer la cryosection à une épaisseur recommandée de 10 à 14 micromètres.

Rassemblez des sections sur des diapositives chargées positivement jusqu’à ce que la région d’intérêt soit atteinte. Récupérez maintenant la lame d’imagerie spatiale unicellulaire dans le bain de glace et retirez la lame du support. Prélevez les sections rangée par rangée à l’aide d’un pinceau à pointe fine pour éviter de rouler.

Appuyez ensuite un coin du produit de congélation vide sur la scène du couteau à l’aide du dos d’un pinceau. Utilisez le haut de la glissière comme point de pivot et abaissez lentement la glissière sur la section pour la laisser adhérer pendant trois secondes avant de la soulever. Alignez les sections en série parallèlement les unes aux autres pour maximiser l’espace sur la diapositive.

Après avoir collecté des sections de la région d’intérêt, replacez la diapositive dans le support de diapositive. Si vous n’avez plus besoin d’échantillons, conservez la lame à 80 degrés Celsius jusqu’à deux semaines avant l’analyse. Prélever des coupes avant et après la région d’intérêt sur une lame de microscope standard chargée positivement et effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine pour évaluer l’alignement de l’échantillon et la qualité de la section avant de procéder à l’analyse.

L’alignement de plusieurs sections a été vérifié en comparant les structures entre les sections d’une même coupe. Les ajustements apportés aux étapes d’intégration et de collecte ont permis à un plus grand nombre de sections de s’intégrer dans la zone d’imagerie d’une lame transcriptomique spatiale. La qualité du signal transcriptomique spatial était élevée dans les régions tissulaires, mais plus faible dans les zones de lames vides en raison de la faible complexité du signal.