In situ Isolement et culture de bactéries récalcitrantes du sol à l’aide d’une puce d’isolement (iChip)

De riches dépôts de microbes existent dans divers environnements naturels, tels que le sol, les plans d’eau et les environnements extrêmes. Cependant, l’exploitation de cette énorme biodiversité est largement limitée par les méthodes de laboratoire et les médias. En franchissant cette barrière culturelle et en exploitant cette biodiversité, nous avons le potentiel de répondre à divers besoins biotechnologiques et de résoudre des défis mondiaux.

Par exemple, le développement de la résistance aux antimicrobiens est devenu une question de santé publique mondiale. Les bactéries du sol qui sont difficiles à cultiver en laboratoire peuvent produire de nouveaux composés bioactifs avec une puissante activité antimicrobienne qui pourraient être précieux pour relever le défi mondial des systèmes antimicrobiens. L’énorme variété de microbes environnementaux et de leurs produits n’a pas été explorée, car les technologies traditionnelles basées sur la culture en laboratoire conduisent souvent à l’isolement de microbes similaires connus. L’objectif de cette expérience est de démontrer la culture à haut débit de bactéries récalcitrantes du sol in situ à l’aide de la technologie IChip. Dans ce protocole, nous démontrerons la construction et l’utilisation de cette technologie IChip qui peut être utilisée pour la culture in situ à haut débit de bactéries difficiles à cultiver et la récupération de bactéries productrices d’antimicrobiens en tant qu’application de cette technologie.

[Présentateur] Pour commencer, créez une conception préliminaire des plaques supérieure, inférieure et centrale de la puce d’isolation dans un logiciel de présentation. Utilisez l’option insérer la forme dans le logiciel de présentation pour insérer des cercles de dimensions nécessaires pour servir d’IChip. Insérez des cercles plus petits à l’intérieur pour représenter les canaux IChip. Disposez les petits cercles dans le motif souhaité pour préparer un dessin préliminaire pour la plaque supérieure, inférieure et centrale de l’IChip. Sélectionnez le design et utilisez le menu contextuel pour enregistrer le design préliminaire sous forme d’image. En utilisant la conception préliminaire comme modèle, commencez à créer une conception bidimensionnelle à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur. Dans le menu d’esquisse, insérez des formes prédéfinies, principalement des cercles, pour créer le design de base des plaques IChip et de la zone des canaux. Utilisez l’option de cote pour définir les dimensions réelles des plaques et des canaux. Cliquez sur OK pour finaliser le design, puis utilisez la fonction d’extrusion pour convertir le design 2D en un modèle 3D de l’épaisseur souhaitée. Enfin, utilisez le menu Fichier pour enregistrer une copie du modèle 3D dans le format de fichier de lithographie compatible avec l’impression 3D.

[Présentateur] Rassemblez tous les articles essentiels qui seront nécessaires pour le prélèvement des échantillons de sol et atteignez le site où l’échantillon doit être prélevé. Ouvrez l’application mobile de géocodage et trouvez l’adresse unique en trois mots du site d’échantillonnage et enregistrez-la. Ensuite, enregistrez les métadonnées pertinentes de l’échantillon, telles que la température, la date, l’heure, la profondeur de l’échantillonnage, les conditions météorologiques et l’exposition du site aux éléments. Vaporisez une pelle et la boîte en polystyrène dans laquelle l’IChip doit être planté avec de l’éthanol à 70 %. Essuyez-les avec du papier de soie et laissez l’éthanol sécher complètement à l’air. Ensuite, utilisez la pelle décontaminée pour enlever tous les débris de surface, tels que la litière de feuilles ou les roches pour exposer la terre végétale. Décontaminez à nouveau la pelle comme avant. À l’aide de la pelle, accédez au sol à une profondeur de trois à six sous la surface et transférez environ quatre à cinq kg de terre d’une profondeur uniforme dans la boîte en polystyrène. La boîte doit être remplie à environ 75 %. Transportez immédiatement le sol collecté au laboratoire. À partir de l’échantillon de sol prélevé, pesez un gramme de sol exempt de débris, de roches et de litière de feuilles dans un tube à centrifuger stérile de 50 mil contenant 10 ml de solution saline stérile. Mélangez le sol avec la solution saline tout en tourbillonnant pendant environ 10 secondes pour créer une boue de sol. Laissez le tube à centrifuger intact pendant cinq minutes pour permettre aux grosses particules de sol dans le tube de se déposer. Ensuite, transférez avec précaution la suspension de sol surnageante dans un tube à essai frais étiqueté S. En utilisant la suspension de sol comme échantillon non dilué, effectuez une dilution zéro en transférant un ml de l’échantillon dans neuf ml de solution saline stérile dans un tube frais. Préparez la dilution de 10 est à la puissance moins un à 10 est à la puissance moins cinq. À l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, décontaminez la plaque supérieure, la plaque inférieure et la plaque centrale de l’IChip en les trempant dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes. Rincez l’excès d’éthanol en lavant les composants IChip avec de l’eau déminéralisée stérile, et laissez-les sécher à l’air libre dans une boîte de Pétri stérile. Placez la plaque centrale de l’IChip dans une boîte de Pétri stérile prête à être ensemenceuse. Faites fondre le milieu gélosé SMS au micro-ondes. Laissez-le refroidir, puis transférez 22,5 ml de gélose SMS à 45 degrés dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml. À cela, ajoutez 2,5 ml d’une dilution appropriée de l’échantillon de sol et mélangez bien par inversion douce tout en évitant l’introduction de bulles d’air. Versez lentement environ trois à quatre ml de gélose SMS épépinée sur la plaque centrale de l’IChip en couvrant toute la surface. Laissez ensuite le milieu gélosé SMS prendre pendant environ cinq à 10 minutes. Vérifiez si le milieu gélosé SMS est réglé. Ensuite, avec la lame de rasoir stérile, grattez l’excès de gélose SMS de la surface de la plaque métallique IChip en laissant derrière vous les bouchons de gélose dans les chambres de diffusion individuelles. Après avoir retiré la feuille de protection de l’un des filtres à membrane en polycarbonate de 0,03 micromètre, placez-la soigneusement à l’intérieur de la lame supérieure de l’IChip à l’aide d’une pince stérile. Placez ensuite un autre filtre à membrane en polycarbonate de 0,03 micromètre sur le côté exposé de la plaque métallique ensemencée à l’aide d’une pince stérile. Placez les plaques supérieure et inférieure de l’IChip, en prenant en sandwich la plaque du milieu, et les membranes en polycarbonate en prenant soin d’aligner ces trous de vis dans toutes les plaques pour compléter l’assemblage de l’IChip. Serrez fermement les écrous et les boulons pour fixer l’ensemble IChip. À l’aide d’une pelle stérile, créez une dépression plus grande que la taille de l’IChip dans le collecteur de sol dans la boîte en polystyrène. Plantez l’IChip verticalement dans la dépression et tassez avec de la terre fermement en veillant à ce que toutes les surfaces de l’IChip soient complètement couvertes. Laisser ensuite la culture in situ pendant la durée souhaitée de deux à quatre semaines. Pendant l’incubation, utilisez de l’eau distillée stérile pour humidifier périodiquement les environs du sol, l’IChip planté, afin d’éviter que les bouchons de gélose SMS ensemencés dans la chambre de diffusion ne se dessèchent. Après l’incubation souhaitée, délogez doucement le sol autour de l’IChip planté pour le récupérer. Ensuite, lavez l’IChip avec une solution saline stérile pour éliminer les particules de sol adhérentes et transférez-le dans une enceinte de biosécurité pour un traitement ultérieur. Détachez les écrous et le boulon de l’IChip et démontez soigneusement l’IChip. À l’aide d’une pince stérile, retirez les membranes en polycarbonate et transférez la plaque centrale de l’IChip dans la boîte de Pétri préparée. À l’aide d’un applicateur en bois stérile, récupérez les bouchons de gélose individuels dans chaque chambre de diffusion. Inoculez les bouchons de gélose dans des milieux appropriés comme la gélose SMS ou la gélose au bouillon de soja tryptique 0,1X pour tenter la culture en laboratoire. Les isolats cultivés peuvent ensuite être soumis à un dépistage de la production d’antimicrobiens par des méthodes de routine, telles que la superposition de gélose à l’aide de souches testeuses. Nous présentons ici des résultats de dépistage représentatifs pour 12 cultures, IC-1 à 12, obtenues à partir de bouchons de gélose IChip contre Staphylococcus aureus ATCC 29213 et Acinetobacter baumannii B8342. Notez que les cultures IC-6 et IC-8 montrent une activité contre les souches testeuses à Gram positif et à Gram négatif respectivement. Alternativement, colorer et imager les bouchons de gélose récupérés contenant des bactéries récalcitrantes du sol cultivées in situ pour confirmer la croissance des microcolonies dans des conditions in situ. En utilisant cette approche, il est possible de récupérer les bactéries récalcitrantes du sol in situ à haut débit. L’IChip imprimé en 3D peut accueillir 156 bouchons de gélose. Cependant, il est nécessaire de choisir la bonne dilution lors de l’ensemencement pour s’assurer qu’une cellule bactérienne est ensemencée dans chaque canal de l’IChip. Les bactéries requises peuvent ensuite être analysées pour déterminer les bioactivités souhaitées, telles que la production de métabolites, la production d’enzymes, la production de biopolymères, etc., si elles peuvent être cultivées dans des conditions de laboratoire. Cependant, il est également probable que certaines bactéries ne se développent pas dans des conditions de laboratoire, et dans de tels cas, nous devrons peut-être adopter des approches métagénomiques pour nous rendre compte de la présence microbienne et accéder à leur potentiel biosynthétique. La méthode décrite est très simple et peut être facilement utilisée pour la bioprospection de microbes dans diverses conditions environnementales avec des modifications mineures.