Cellules de crête neurale crânienne : protocole de différenciation in vitro tridimensionnelle pour le dosage multiplexé

Ce qui nous intéresse, c’est de comprendre comment certaines décisions sont régulées au cours du développement. Les modèles organoïdes et les technologies mono-cellomiques nous permettent de poser des questions qui n’étaient pas possibles auparavant. L’utilisation de modèles organoïdes in vitro nous permet de générer une plus grande quantité de données, en particulier pour les populations cellulaires transitoires, telles que la crête neurale.

Les résultats significatifs du modèle de variabilité restent un défi expérimental majeur. Nous avons démontré que les cellules de la crête crânienne réexpriment les gènes de prépuissance pour élargir le potentiel de différenciation. Pour commencer, préparez une solution fraîche de collagénase à une concentration de deux milligrammes par millilitre dans le milieu d’élimination DMEM.

Aspirer le milieu ESC de la plaque du puits contenant 70 à 80 % d’ESCm confluente. Maintenant, ajoutez doucement un millilitre de PBS sur le côté du puits. Basculez la plaque pour assurer un lavage uniforme.

Pipetez le PBS et remplacez-le par deux millilitres de solution de collagénase. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes. Vérifiez la plaque au microscope optique à un grossissement de 10X après 20 minutes d’incubation, puis toutes les cinq minutes.

Lorsque les colonies présentent des bords enroulés, tapotez vigoureusement sur le côté de la plaque pour détacher les colonies. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, prélevez les colonies détachées et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les colonies à 16 G pendant trois minutes à température ambiante.

Aspirez autant de milieu que possible du tube conique sans déranger les colonies au fond. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de trypsine à 0,05 % à la pastille et incuber. À l’aide d’une micropipette P1000 et P200, pipeter vigoureusement la suspension de haut en bas pour dissocier les colonies, puis ajouter deux millilitres de milieu de culture mESC pour bloquer la trypsine.

Centrifugez le tube à 160 G pendant trois minutes à température ambiante. Pipetez le surnageant, puis ajoutez un millilitre de milieu de différenciation CNCC. Comptez les cellules à l’aide d’un appareil de comptage automatisé ou au microscope, puis diluez les cellules dans un milieu de différenciation CNCC pour obtenir une concentration de 3 000 cellules vivantes par 50 microlitres.

À l’aide d’une micropipette P200, ensemencez 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond en U non traitée par TC. Remplissez chaque puits à 200 microlitres avec le milieu de différenciation CNCC et incubez. Observez la plaque contenant la culture de cellules différenciées de 24 heures au microscope optique pour vous assurer que de petits amas avec des bords clairs sont visibles au fond de chaque puits.

Remettez la plaque dans l’incubateur pendant la nuit. Le deuxième jour, retirez lentement 100 microlitres de milieu de chaque puits. Ensuite, utilisez une micropipette P200 dont la pointe est coupée à trois ou quatre millimètres de l’extrémité pour aspirer les neurosphères avec le milieu restant.

Transférez les neurosphères et le milieu restant dans une plaque à fond plat de 96 puits non traitée par TC. Vérifiez le transfert au microscope optique. Remplissez chaque puits à 200 microlitres de milieu de différenciation CNCC préchauffé.

Le quatrième jour, aspirez 100 microlitres de milieu de chaque puits. Remplacez-le par 100 microlitres de milieu de différenciation CNCC préchauffé, puis incubez à nouveau. Les cinquième et sixième jours, vérifiez l’attachement des neurosphères au microscope optique.

Assurez-vous que les cellules plus légères qui se délaminent des neurosphères commencent à entourer son corps principal. Préparez le milieu d’entretien CNCC selon la composition indiquée. Filtrez l’albumine sérique bovine à travers un filtre de 0,22 micromètre avant de l’ajouter au milieu.

Une fois les facteurs de croissance ajoutés, conservez le milieu à quatre degrés Celsius jusqu’à trois semaines, en vous assurant qu’il est protégé de la lumière. Ajoutez 100 microlitres de solution de fibronectine dans chaque puits d’une plaque de 96 puits non traitée par TC. Pendant que la plaque repose, aspirer autant de milieu de différenciation CNCC que possible des puits de la plaque à fond plat à 96 puits non traitée par TC.

Remplacez le milieu par 50 microlitres d’Accutase. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu d’entretien CNCC dans chaque puits pour tremper l’Accutase.

Retirez la fibronectine des puits recouverts de la plaque réceptrice. puis filtrer le CNCC post-migratoire détaché à travers un filtre de 40 micromètres dans les puits de la plaque réceptrice. Au moment souhaité, utilisez une micropipette P200 à pointe coupée pour transférer les neurosphères de la plaque de 96 puits dans un tube de deux millilitres à faible liaison d’ADN.

Après avoir laissé les neurosphères se déposer dans le tube pendant trois minutes à température ambiante, pipetez autant de fluide que possible, puis rincez avec un millilitre de PBS froid. Pour préparer les chambres de montage, placez trois couches de ruban adhésif transparent sans fibres double face sur une lame de microscope. À l’aide d’un rasoir, découpez une fenêtre de trois millimètres sur huit millimètres dans le ruban adhésif double face.

Sous un stéréoscope, avec une pointe coupée P200, pipetez soigneusement les neurosphères de l’agent nettoyant dans la chambre de montage. Utilisez des grossissements entre 2X et 4X pour fournir un champ de vision de l’ensemble de la chambre et identifier les neurosphères. Placez une lamelle sur la surface de la chambre et appuyez légèrement sur ses côtés pour la faire adhérer.

Les cultures de neurosphères dans des plaques non tissulaires ont montré des attaches uniformes à partir du cinquième jour, tandis que les cultures de boîtes de Pétri ont montré une attache et une fusion variables des neurosphères, particulièrement évidentes au quatrième jour. La variabilité de la taille des neurosphères a été considérablement réduite dans les cultures sur plaques à 96 puits par rapport aux cultures en boîte de Pétri aux jours quatre et sept. Le diamètre des neurosphères dans les plaques à 96 puits variait de 139 micromètres à 295 micromètres le quatrième jour et de 383 micromètres à 552 micromètres le septième jour, tandis que les cultures de boîtes de Pétri présentaient une gamme plus large.

La croissance de la neurosphère a été exponentielle en termes de nombre de cellules, passant d’une moyenne de 1 082 cellules le deuxième jour à 48 352 cellules le neuvième jour. La croissance du diamètre a été linéaire, passant d’une moyenne de 136 micromètres le deuxième jour à 570 micromètres le neuvième jour. L’analyse par immunofluorescence a confirmé que les neurosphères et les cellules en délamination expriment les marqueurs CNCC AP2 alpha et SOX9 et le marqueur EMT TWIST1 aux jours neuf et 13.

PAX7 n’était présent que dans les neurosphères.