Caractérisation des vésicules extracellulaires à partir de fluides biologiques
28 février 2025
Ici, nous démontrons la méthode de caractérisation des vésicules extracellulaires (VE) collectées à partir de fluides biologiques, tels que les larmes et la salive, de sujets humains. Le scanner utilisé dans cette méthode est capable de détecter le phénotype, la taille et le nombre total de particules des VE à partir de 1 μL de l’échantillon.
Les vésicules extracellulaires servent de biomarqueurs de la maladie, reflétant les états physiologiques. Notre approche permet l’extraction de données riches à partir de minuscules volumes de larmes, faisant ainsi progresser la recherche sur les VE dans les fluides biologiques. Les principaux défis expérimentaux comprennent l’obtention de concentrations suffisantes de vésicules extracellulaires à partir de petits échantillons, la minimisation de la perte d’échantillons pendant l’isolement et l’optimisation de l’analyse pour éviter la sursaturation des puces ou la détection de signaux faibles.
Ce protocole contourne les étapes d’isolement, ce qui réduit le temps de traitement, et permet l’analyse des vésicules extracellulaires à partir de petits volumes d’échantillons, ce qui le rend idéal pour les échantillons biologiques limités, comme les déchirures. Les biomarqueurs non invasifs sont essentiels pour la détection précoce et la prise en charge des troubles cornéens. Les biomarqueurs des vésicules extracellulaires permettent de surveiller les maladies, d’améliorer les traitements personnalisés, d’améliorer l’observance des patients et d’améliorer la qualité de vie.
Notre laboratoire a été le premier à analyser les vésicules extracellulaires dans des échantillons de larmes de sujets KC, identifiant des signatures tEV uniques. Cela ouvre la voie à de futurs diagnostics et à des cibles thérapeutiques axées sur les VE. Pour commencer, placez les échantillons biologiques et une puce de tétraspanine sur l’espace de travail.
Pipette 70 microlitres d’échantillons biologiques humains prémélangés avec la solution B d’un kit de tétraspanine humaine sur une puce. Placez le film sur une plaque de lavage des copeaux pour éviter l’évaporation de l’échantillon. Après 16 heures, placez la plaque dans la rondelle de copeaux.
Verrouillez-le en place et fermez le couvercle. Appuyez sur l’option CW-TETRA v0 sur la rondelle de copeaux. Pendant que les copeaux sont lavés, préparez 300 microlitres de solution de blocage par puce.
Ajoutez 0,6 microlitre de chaque anticorps par puce à la solution de blocage. Vortex la solution de blocage avec le cocktail d’anticorps pour assurer un mélange complet. Lorsque le lavage des copeaux est terminé, ajoutez 250 microlitres de solution de blocage avec le cocktail d’anticorps sur chaque chips.
Fermez ensuite le couvercle et appuyez sur Continuer. Lorsque le rond-copeaux émet un bip, retirez la plaque de lavage des copeaux. Déplacez les jetons vers le haut de la rampe.
Remettez la plaque dans la rondelle à copeaux, en vous assurant qu’elle se verrouille solidement en place. Fermez le couvercle et appuyez sur Continuer. Pour commencer, allumez un analyseur de nanoparticules.
Lancez le logiciel de balayage sur le bureau connecté à l’analyseur de nanoparticules. Sélectionnez le dossier des puces pour choisir chaque puce tétraspanine et localisez-la dans la position de la puce sur le mandrin. Cliquez sur les trois cases sous Position de la puce pour activer la fluorescence.
Les carrés deviendront jaunes, bleus et rouges. Appuyez sur le couvercle du mandrin et tirez-le pour le retirer. Ensuite, fixez fermement les copeaux de tétraspanine chargés d’échantillons sur le mandrin.
Alignez les chevilles du couvercle du mandrin avec les trous et appuyez vers le bas. Faites glisser le couvercle pour le verrouiller en place. Placez ensuite le mandrin sur la platine et verrouillez-le en place.
Ensuite, cliquez sur Scanner les puces dans l’interface du logiciel, puis cliquez sur OK. Une fois que la platine est complètement entrée dans la machine, fermez la porte. Une fois l’analyse terminée, ouvrez la porte pour éjecter l’étage et vérifier les résultats. Si les analyses ont réussi, jetez les puces.
Placez le prochain ensemble de chips sur le mandrin. Vous pouvez également remettre le mandrin vide sur la scène. Quittez le logiciel et éteignez la machine lorsque vous avez terminé.
Des niveaux de fluorescence optimaux des vésicules extracellulaires ont été observés dans les canaux CD63, CD81 et CD9, tandis que le canal de contrôle MIgG est resté noir, confirmant la spécificité du contrôle. Le CD81 a été réduit pour les fluides biologiques. L’absence de fluorescence dans les canaux CD63, CD81 et CD9 est indicative d’une absence de vésicules extracellulaires.
La sursaturation de la fluorescence était évidente, ce qui rendait difficile la discernement de données significatives en raison d’un marquage excessif, en particulier dans les canaux CD63, CD81 et CD9.
Aperçu
Cette étude présente une nouvelle méthode pour caractériser les vésicules extracellulaires (EV) collectées à partir de fluides biologiques humains, tels que les larmes et la salive. En utilisant une puce tetraspanine, l'approche facilite l'analyse des EV à partir de volumes d'échantillons minimaux, faisant progresser l'étude des biomarqueurs non invasifs pour la surveillance des maladies.
Composants clés de l'étude
Domaine de recherche
- Vésicules extracellulaires
- Biomarqueurs non invasifs
- Maladies oculaires
Contexte
- Les EV servent d'indicateurs des états physiologiques et des maladies
- Les défis incluent les faibles concentrations dans les petits échantillons et le temps de traitement des échantillons
- Importance de la détection précoce des troubles cornéens
Méthodes utilisées
- Utilisation d'une puce tetraspanine pour l'analyse des EV
- Échantillons biologiques humains (larmes)
- Détection par fluorescence des marqueurs EV CD63, CD81 et CD9
Résultats principaux
- L'intégration des étapes de préparation et d'analyse des échantillons réduit le temps de traitement
- Les niveaux de fluorescence des marqueurs EV confirment la spécificité et la présence
- Identification de signatures tEV dans les échantillons de larmes de sujets atteints de kératocône
Conclusions
- Cette méthode fournit une approche rationalisée pour l'analyse des EV à partir de petits échantillons biologiques
- Les résultats soutiennent les diagnostics futurs et les cibles thérapeutiques en santé oculaire
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
