Name: Caractérisation des vésicules extracellulaires à partir de fluides biologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Découvrez la caractérisation des vésicules extracellulaires dans les fluides biologiques humains comme les larmes. Cette méthode par puce à tétraspanines réduit le temps de traitement et facilite l'analyse de petits échantillons pour le diagnostic oculaire.

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<table><tbody><tr><td>ChipWasher 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100</td><td>Incuber, laver, rince et sèche les copeaux de tétraspanine. Ce modèle actuel n’est plus disponible. Prix au moment de l’achat : 9 995,00 $</td></tr><tr><td>Logiciel ExoView Analyzer</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Analyse les informations de la puce et produit des fichiers Excel pour une analyse plus approfondie. N’est plus disponible.</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>Utilisé pour scanner les puces de tétraspanine à 3 longueurs d’onde. Ce modèle actuel n’est plus disponible. Prix au moment de l’achat :&nbsp ; $110,000.00</td></tr><tr><td>Logiciel ExoView Scanner</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Scanne les puces à 3 longueurs d’onde différentes. N’est plus disponible.</td></tr><tr><td></td><td>EV-TETRA-C</td><td>Comprend 8 puces de tétraspanine, une solution d’incubation, une solution de blocage, un anticorps CD63, un anticorps CD81, un anticorps CD9, une solution A, une solution B, une clé USB et un couvercle de plaque.</td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation des vésicules extracellulaires à partir de fluides biologiques

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

Lors de l’analyse des taches sur les puces, visez une concentration optimale de VE en observant les VE marqués par fluorescence dans les canaux CD63, CD81 et CD9, et le canal MIgG30,91 doit rester noir, car il s’agit du canal de contrôle comme le montre la figure 3A. Le taux de CD81 sera réduit pour les fluides biologiques. S’il n’y a pas de fluorescence dans les canaux CD63, CD81 et CD9, il y a absence de VE (Figure 3B). Veillez à ne pas trop saturer la puce (Figure 3C). Il sera donc difficile pour le logiciel d’analyse de calculer la précision de la taille, du nombre total de particules et des phénotypes des VE. À partir des points de concentration optimale, le logiciel d’analyse sera en mesure de mesurer la taille (50-200 nm), le nombre total de particules et l’expression de la tétraspanine des VE (figure 4) et sera exporté dans des feuilles de calcul individuelles pour une analyse plus approfondie. L’analyse de la tétraspanine inclura la colocalisation des protéines de surface sur les VE. La colocalisation sera représentée par un « / », par exemple, « CD63/CD81 ». Cela ne signifie pas que CD63 et CD81 sont combinés ; cela signifie que CD63 et CD81 sont situés à la surface du VE.
Ces résultats fourniront des informations précieuses entre les échantillons sains et malades. Nous serons en mesure de déterminer si des échantillons sains ou des échantillons malades produisent plus de VE, des VE plus grands ou plus petits, et le phénotype des VE. L’une ou l’autre de ces caractéristiques pourrait jouer un rôle dans la biogenèse et/ou la progression de la maladie. Grâce à ces résultats, nous serons en mesure de voir s’il y a une absence ou une augmentation des niveaux de tétraspanine, ce qui peut donner un aperçu des processus cellulaires et de la formation des VE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg"> 
Figure 1 : Les types et les tailles des différents VE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg"> 
Figure 2 : Schéma de la façon dont les puces tétraspanine capturent et détectent les VE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg"> 
Figure 3 : Optimisation des concentrations de VE. (A) Concentration optimale des VE. (B) Résultat négatif : aucun VE présent. (C) Sursaturation des VE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg"> 
Figure 4 : Données générées par l’analyseur de nanoparticules. (A) Taille du diamètre de l’IL mesurée en nanomètres. (B) Nombre total de particules des VE. (C) Phénotype colocalisé EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technique</td>
			<td>Avantages</td>
			<td>Limitations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Haute pureté42,43</td>
			<td>Changements de morphologie EV42,44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Homogénéité42,45</td>
			<td>Nécessite un grand volume42,44,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fonctionnalité42,43</td>
			<td>Cher42,43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytométrie en flux</td>
			<td>Évaluation d’échantillons à plusieurs points temporels47</td>
			<td>Signal faible48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plusieurs points de terminaison47,50</td>
			<td>Pores obstrués51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Analyse d’un seul véhicule électrique à haut débit52,53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation à gradient de densité</td>
			<td>Produire des échantillons d’une grande pureté54</td>
			<td>Main-d’œuvreintensive 55,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Variété d’échantillons55,57</td>
			<td>Chronophage55,58 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Perte de rendement importante54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Précipitation</td>
			<td>Simple59,60</td>
			<td>Contamination36,44,61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rapide61,62</td>
			<td>Non spécifique63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Haut rendement44,59,62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH neutre36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration</td>
			<td>Simple64 </td>
			<td>Exosomes pièges65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rapide64</td>
			<td>Endommage les grandes vésicules36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Bon marché64</td>
			<td>Gâteau de filtration66,67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obstruction des exosomes65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Avantages et limites des techniques d’isolation des VE. Une liste des différentes façons d’isoler les VE, y compris leurs avantages et leurs limites.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technique</td>
			<td>Avantages</td>
			<td>Limitations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffusion dynamique de la lumière</td>
			<td>Mesure de particules dont la taille varie de 1 nm à 6 μM78 </td>
			<td>Ne convient pas pour la mesure d’échantillons d’exosomes complexes avec une grande plage de taille79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>La limite inférieure est de 10 nm, ce qui convient aux systèmes monodispersés79 </td>
			<td>Impossible de distinguer les protéines contaminées des exosomes79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopie électronique à transmission (MET)</td>
			<td>Observer la morphologie des exosomes79,80 </td>
			<td>Préparations d’échantillons compliquées79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Observer la structure interne81 </td>
			<td>Impossible de distinguer les exosomes en fonction de leur taille et de leur forme en raison de signaux de fluorescence exagérés82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyse du suivi des nanoparticules</td>
			<td>Mesure de la concentration, de la taille et de la distribution granulométrique des exosomes dans la gamme de 10 nm à 2 μM78 </td>
			<td>Impossible de différencier les VE des agrégats de protéines et d’autres contaminants83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Préparation et mesure rapides des échantillons78,84</td>
			<td>Instrument NTA85 coûteux </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Les échantillons peuvent être récupérés sous forme native84 </td>
			<td>Sensible aux vibrations85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot (WBs)</td>
			<td>peut analyser qualitativement et quantitativement les protéines marqueurs79,86 </td>
			<td>Compliqué et chronophage79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Analyse d’exosomes à partir de milieux de culture cellulaire79 </td>
			<td>Les isolats de VE peuvent contenir des lipoprotéines et d’autres contaminants86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Cytométrie en flux</td>
			<td>Une sensibilité plus élevée et une imagerie haute résolution pour</td>
			<td rowspan="2">Chronophage et laborieux avec une limite de détection de 400 nm79,88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distinguer les exosomes colorés des confinements87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Faible concentration d’échantillon requise79 </td>
			<td>Les signaux optiques entravent la précision et la résolution88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exoview</td>
			<td>Mesurer les tétraspanines (CD9, CD63 et CD81) sur les exosomes89 </td>
			<td>Ne mesure pas les grandes tailles de VE75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mesure les protéines cargo EV90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Avantages et limites des techniques de caractérisation des VE.

Caractérisation des vésicules extracellulaires à partir de fluides biologiques

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

Les vésicules extracellulaires servent de biomarqueurs de la maladie, reflétant les états physiologiques. Notre approche permet l’extraction de données riches à partir de minuscules volumes de larmes, faisant ainsi progresser la recherche sur les VE dans les fluides biologiques. Les principaux défis expérimentaux comprennent l’obtention de concentrations suffisantes de vésicules extracellulaires à partir de petits échantillons, la minimisation de la perte d’échantillons pendant l’isolement et l’optimisation de l’analyse pour éviter la sursaturation des puces ou la détection de signaux faibles.Ce protocole contourne les étapes d’isolement, ce qui réduit le temps de traitement, et permet l’analyse des vésicules extracellulaires à partir de petits volumes d’échantillons, ce qui le rend idéal pour les échantillons biologiques limités, comme les déchirures. Les biomarqueurs non invasifs sont essentiels pour la détection précoce et la prise en charge des troubles cornéens. Les biomarqueurs des vésicules extracellulaires permettent de surveiller les maladies, d’améliorer les traitements personnalisés, d’améliorer l’observance des patients et d’améliorer la qualité de vie.Notre laboratoire a été le premier à analyser les vésicules extracellulaires dans des échantillons de larmes de sujets KC, identifiant des signatures tEV uniques. Cela ouvre la voie à de futurs diagnostics et à des cibles thérapeutiques axées sur les VE. Pour commencer, placez les échantillons biologiques et une puce de tétraspanine sur l’espace de travail.Pipette 70 microlitres d’échantillons biologiques humains prémélangés avec la solution B d’un kit de tétraspanine humaine sur une puce. Placez le film sur une plaque de lavage des copeaux pour éviter l’évaporation de l’échantillon. Après 16 heures, placez la plaque dans la rondelle de copeaux.Verrouillez-le en place et fermez le couvercle. Appuyez sur l’option CW-TETRA v0 sur la rondelle de copeaux. Pendant que les copeaux sont lavés, préparez 300 microlitres de solution de blocage par puce.Ajoutez 0,6 microlitre de chaque anticorps par puce à la solution de blocage. Vortex la solution de blocage avec le cocktail d’anticorps pour assurer un mélange complet. Lorsque le lavage des copeaux est terminé, ajoutez 250 microlitres de solution de blocage avec le cocktail d’anticorps sur chaque chips.Fermez ensuite le couvercle et appuyez sur Continuer. Lorsque le rond-copeaux émet un bip, retirez la plaque de lavage des copeaux. Déplacez les jetons vers le haut de la rampe.Remettez la plaque dans la rondelle à copeaux, en vous assurant qu’elle se verrouille solidement en place. Fermez le couvercle et appuyez sur Continuer. Pour commencer, allumez un analyseur de nanoparticules.Lancez le logiciel de balayage sur le bureau connecté à l’analyseur de nanoparticules. Sélectionnez le dossier des puces pour choisir chaque puce tétraspanine et localisez-la dans la position de la puce sur le mandrin. Cliquez sur les trois cases sous Position de la puce pour activer la fluorescence.Les carrés deviendront jaunes, bleus et rouges. Appuyez sur le couvercle du mandrin et tirez-le pour le retirer. Ensuite, fixez fermement les copeaux de tétraspanine chargés d’échantillons sur le mandrin.Alignez les chevilles du couvercle du mandrin avec les trous et appuyez vers le bas. Faites glisser le couvercle pour le verrouiller en place. Placez ensuite le mandrin sur la platine et verrouillez-le en place.Ensuite, cliquez sur Scanner les puces dans l’interface du logiciel, puis cliquez sur OK. Une fois que la platine est complètement entrée dans la machine, fermez la porte. Une fois l’analyse terminée, ouvrez la porte pour éjecter l’étage et vérifier les résultats. Si les analyses ont réussi, jetez les puces.Placez le prochain ensemble de chips sur le mandrin. Vous pouvez également remettre le mandrin vide sur la scène. Quittez le logiciel et éteignez la machine lorsque vous avez terminé.Des niveaux de fluorescence optimaux des vésicules extracellulaires ont été observés dans les canaux CD63, CD81 et CD9, tandis que le canal de contrôle MIgG est resté noir, confirmant la spécificité du contrôle. Le CD81 a été réduit pour les fluides biologiques. L’absence de fluorescence dans les canaux CD63, CD81 et CD9 est indicative d’une absence de vésicules extracellulaires.La sursaturation de la fluorescence était évidente, ce qui rendait difficile la discernement de données significatives en raison d’un marquage excessif, en particulier dans les canaux CD63, CD81 et CD9.

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Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Les vésicules extracellulaires présentes dans le sang ont été suggérées comme de nouveaux biomarqueurs pour diverses maladies. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement de grandes microvésicules dérivées de membranes plasmiques à partir d’échantillons de sang périphérique et leur analyse ultérieure par cytométrie en flux conventionnelle et Western Blot.

Isolement et caractérisation de microvésicules dans le sang périphérique

Dans ce protocole, nous décrivons le flux de travail complet pour isolation rapide des vésicules extracellulaires du sang humain et de la caractérisation des marqueurs spécifiques par analyse de suivi des nanoparticules axée sur la fluorescence. Les résultats présentés montrent une reproductibilité élevée et peuvent être ajustées pour les surnageants de culture cellulaire.

Caractérisation de basés sur la Fluorescence rapide unique vésicules extracellulaire dans le sang humain avec analyse de suivi des nanoparticules

Le protocole décrit une méthode reproductible, conçue pour être utilisé avec les surnageants de culture de cellules pour détecter des épitopes de surface sur petites vésicules extracellulaires (EV). Il utilise l’immunoprécipitation de EV spécifique à l’aide de billes couplées avec des anticorps qui reconnaissent l’antigène de surface CD9, CD63 et CD81. La méthode est optimisée pour l’analyse en cytométrie en flux en aval.

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’isoler les petites vésicules extracellulaires (EVs) de tissus entiers, y compris des échantillons de cerveau et la tumeur. Cette méthode offre une technique reproductible pour extraire les EVs de tissu plein pour approfondir les analyses en aval.

Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Le présent rapport souligne les exigences chronologiques pour l’isolement extracellulaire de vésicule (EV) des microglies ou des macrophages de sang. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont été évalués en tant que régulateurs de la excroissance neurite tandis que les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été étudiés dans le contrôle de l’invasion de cellules de glioma C6 dans les essais in vitro. L’objectif est de mieux comprendre ces fonctions EV en tant que...

Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire

Le protocole démontre ici que les vésicules extracellulaires peuvent être séparées de manière adéquate des milieux de culture cellulaire conditionnés en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille.

Chromatographie d’exclusion de taille pour séparer les vésicules extracellulaires des milieux de culture cellulaire conditionnés

Le présent protocole décrit une méthode pour extraire les vésicules extracellulaires du sang périphérique et des tissus solides avec profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons de protéines.

Isolement et analyse de vésicules extracellulaires traçables et fonctionnalisées à partir du plasma et des tissus solides

La dernière génération d’outils de caractérisation des véhicules électriques est capable d’analyser simultanément plusieurs paramètres uniques. La cytométrie en nanoflux mesure toutes les particules biologiques de plus de 45 nm sans marquage et identifie les caractéristiques spécifiques des sous-populations par diverses techniques de marquage fluorescent.

Caractérisation de la protéine transmembranaire d’une vésicule extracellulaire unique par cytométrie nano-flux

Cet article décrit une méthodologie pour l’isolement, la caractérisation et la quantification des vésicules extracellulaires (VE) dérivées du plasma humain et présente un flux de travail pour l’analyse sans marquage du protéome EV à l’aide de la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).

Isolement, caractérisation et analyse protéomique de vésicules extracellulaires dérivées du plasma pour la découverte de biomarqueurs cardiovasculaires

Ce protocole fournit une description détaillée du tri des vésicules extracellulaires (VE) libérées par les cellules stromales mésenchymateuses. Il se concentre en particulier sur le réglage de l’instrument et l’optimisation des conditions de tri. L’objectif est de trier les vésicules extracellulaires tout en préservant leurs caractéristiques.

Mise en place d’un tri réussi pour l’isolement des vésicules extracellulaires

Découvrez la caractérisation des vésicules extracellulaires dans les fluides biologiques humains comme les larmes. Cette méthode par puce à tétraspanines réduit le temps de traitement et facilite l'analyse de petits échantillons pour le diagnostic oculaire.

Caractérisation des vésicules extracellulaires à partir de fluides biologiques

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