Name: Innervation des organoïdes intestinaux humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Découvrez l'innervation des organoïdes intestinaux humains pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode intègre le système nerveux entérique pour améliorer la fonctionnalité et offrir des solutions thérapeutiques aux enfants atteints d'insuffisance intestinale.

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<ol><li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Semin Pediatr Surg. 19 (1), 3-9 (2010).</li>
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<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enteric+neuron+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).</li>
<li>Finkbeiner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analysis+reveals+hallmarks+of+human+intestine+development+and+maturation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo.</a> Stem Cell Rep. 4 (6), 1140-1155 (2015).</li>
<li>Boyle, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+transplantation+of+human+intestinal+organoids+enhances+select+tight+junction+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo transplantation of human intestinal organoids enhances select tight junction gene expression.</a> J Surg Res. 259, 500-508 (2021).</li>
<li>Finkbeiner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue-engineered+small+intestine+using+embryonic+stem+cell-derived+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue-engineered small intestine using embryonic stem cell-derived human intestinal organoids.</a> Biol Open. 4 (11), 1462-1472 (2015).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Solution d’acides aminés non essentiels (NEAA)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes coniques</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07920</td><td>"réactif de détachement de cellules enzymatiques"</td></tr><tr><td>Supplément B-27 (50x), moins vitamine A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12587010</td><td>pour ENCC</td></tr><tr><td>Supplément B-27 (50x), sans sérum</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Pour HIO</td></tr><tr><td>Bright-Line Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Microplates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Corning Flat-Bottom Plate Plate 24 puits, TC traité</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 puits</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2858501</td><td>Milieux alternatifs à base de cellules souches, utilisés pour les plaques ENCC.</td></tr><tr><td>Pince à pointe fine</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle i160</td><td>Thermo Scientific</td><td>50145522</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Gibco HEPES 1 M</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Neurobasal Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutagro, 200 mM, 100x</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>H9 human ESC</td><td>Wicell International Stem Cell Stem Cell Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HyCloneTM FBS Defined</td><td>VWR</td><td>16777-002</td><td></td></tr><tr><td>Armoire de sécurité biologique LabGard</td><td>Nuaire</td><td>Nu-430-400</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR Matrice de membrane basale, sans rouge de phénol, sans LDEV</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>"Matrice de membrane basale 3D transparente"</td></tr><tr><td>Matrice qualifiée Matrigel hESC, sans LDEV</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>"Matrice de membrane basale 3D"</td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td>Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0,5-10, 0,1-2,5 μL)</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>"Milieu de cellules souches" Le numéro de catalogue comprend le supplément 5x, à ajouter en vrac à l’avance.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Supplément N-2 (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>pour HIO</td></tr><tr><td>Supplément N-2, CTS (Cell Therapy Systems)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1370701</td><td>pour ENCC. Formulation légèrement différente.</td></tr><tr><td>Microscope Nikon DS-Fi2 TS-100</td><td>Média</td> conditionné Nikon <td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td> Texas <td>Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroïde/Organoïde Sous-noyau</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Systèmes de guidage cellulaire</td><td>d’activine A humaine recombinante</td><td>GFH6-100</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant BMP-4</td><td>Fisher Scientific</td><td>314BP010</td><td></td></tr><tr><td>Protéine EGF humaine recombinante, CF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Protéine FGF humaine recombinante basique/FGF2 (146 aa)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>233-FB-010</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant FGF-4</td><td>Peprotech</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5872</td><td>« Réactif de dissociation des cellules souches"</td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>SIGMA</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microfuges sans Rnase, 2 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12425</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin Milieux conditionnés</td><td>Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Sous-noyau entéroïde/organoïde</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542, Tocris Bioscience</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall ST 16R</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Pointes de pipette à large orifice</td><td>VWR</td><td>89049-166</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Chir99021 en solution</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette à filtre stérile</td><td>VWR (1000uL, 200uL, 10uL)</td><td>76322-154, 76322-150, 89174-520</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectine XF</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7180</td><td>Matrice de membrane basale 3D alternative, utilisée pour les plaques ENCC.</td></tr></tbody></table>

innervation des organoïdes intestinaux humains

Innervation of Human Intestinal Organoids

Le SNE régule les fonctions essentielles de l’intestin grêle mature, notamment le péristaltisme, l’absorption des nutriments, le transport des fluides et le maintien de la barrière épithéliale. Ainsi, l’objectif de l’innervation des DOI est de fournir à ces constructions les éléments nécessaires à l’élaboration d’une fonctionnalité plus mature et de niveau supérieur. À cette fin, notre laboratoire étudie spécifiquement le développement de l’ENS au sein des HIO ainsi que les résultats fonctionnels à différentes étapes.</p...

Innervation des organoïdes intestinaux humains

The complexity of intestinal cytoarchitecture and function poses significant challenges for the creation of the bioengineered small intestine. Techniques ...

Notre recherche se concentre sur la génération d’intestins issus de l’ingénierie tissulaire comme solution au syndrome de l’intestin court. Notre laboratoire se concentre sur l’optimisation de l’intégration d’un système nerveux entérique et l’optimisation de l’organisation spatiale, de la diversité cellulaire et de la fonction. Nous espérons qu’un jour nous pourrons créer une solution qui changera la vie des enfants souffrant d’insuffisance intestinale en créant un intestin bio-modifié.L’innervation des organoïdes intestinaux humains nécessite d’imiter le développement intestinal humain, ce qui peut être difficile. Le développement du système nerveux entérique nécessite à la fois une signalisation biochimique et des forces biomécaniques. Les études futures de notre laboratoire sont axées sur l’optimisation du développement du système nerveux entérique dans les organoïdes intestinaux humains.Nous étudions l’organisation spatiale ainsi que la diversité cellulaire, et nous avons récemment utilisé une nouvelle technique d’imagerie 3D développée par le Dr Herath qui peut caractériser et quantifier de manière robuste le SNE dans nos organoïdes intestinaux. Cela nous aidera à affiner notre modèle et à récapituler le développement et la fonction intestinaux humains. Tout d’abord, prenez la plaque de cellules entériques de la crête neurale entérique en culture du 15e au 21e jour ou sphéroïdes ENCC et retirez soigneusement le milieu du puits.Ajoutez un millilitre d’un réactif chaud de détachement de cellules enzymatiques dans le puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Tapotez ensuite le côté de la plaque pour faciliter la dissociation des sphéroïdes. À l’aide d’une micropipette P1000 avec une pointe à large ouverture, titrez le mélange en pipetant doucement de haut en bas jusqu’à ce que les cellules soient homogènes.Transférez la suspension ENCC dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez le puits avec un millilitre de milieu cellulaire chaud pour recueillir les cellules restantes, puis ajoutez-le dans le tube conique. Centrifugez maintenant la suspension cellulaire à 300 G pendant une minute.Aspirez ensuite le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette stérile. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu cellulaire chaud de la crête neurale. Prélevez les sphéroïdes de l’intestin moyen de l’intestin moyen cultivés dans tous les puits d’une plaque organoïde intestinale humaine à l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.Ajoutez le volume calculé de suspension ENCC dans le tube conique contenant les sphéroïdes de l’intestin moyen. À l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture, tritez doucement le mélange pour mélanger uniformément les sphéroïdes et les ENCC. Centrifuger la suspension cellulaire combinée à 300 G pendant une minute.Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette stérile. Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire résultante dans une matrice de membrane basale froide sans facteur de croissance sans phénol. Ensuite, pipetez la gouttelette de 30 microlitres des sphéroïdes de l’intestin moyen postérieur et des ENCC en suspension dans la matrice de la membrane basale transparente au centre de chaque puits sec.Une fois que toutes les gouttelettes sont placées, couvrez la plaque, retournez-la et placez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Le jour zéro, une fois que la matrice transparente de la membrane basale a polymérisé, recouvrez chaque gouttelette de 500 microlitres de milieu HIO chaud du jour zéro à trois MIO. Le troisième jour, aspirer soigneusement le milieu HIO du jour zéro à trois du côté de chaque puits sans perturber la gouttelette de matrice transparente de la membrane basale.Remplacez-le par 500 microlitres de milieu HIO chaud de la troisième à 14 journées et remettez la plaque dans l’incubateur. Le 14e jour, examinez chaque puits au microscope pour évaluer le nombre de structures HIO+ENS en développement dans chaque gouttelette de matrice de membrane basale 3D transparente. Ajoutez 30 microlitres de matrice de membrane basale transparente dans des tubes de microcentrifugation de deux millilitres et maintenez-les sur de la glace.Sous une hotte à flux laminaire, à l’aide d’une pince fine, retirez soigneusement la gouttelette de matrice de membrane basale 3D transparente contenant le HIO+ENS en suspension. Séparez doucement les structures individuelles HIO+ENS à l’aide de la pince. À l’aide d’une pince fine ou d’une pointe de pipette à large ouverture, placez chaque structure HIO+ENS isolée dans les tubes de microcentrifugation contenant 30 microlitres de matrice de membrane basale transparente.Ensuite, pipetez une gouttelette de 30 microlitres de HIO+ENS en suspension dans une matrice de membrane basale transparente au centre de chaque puits sec. Une fois que les gouttelettes ont polymérisé, ajoutez 500 microlitres de milieu chaud et frais du troisième jour à 14 milieux HIO+ENS dans chaque puits et incubez la plaque pendant la nuit. Le 15e jour, aspirez soigneusement le milieu du troisième à 14e jour sur le côté de chaque puits sans perturber la gouttelette polymérisée.Remplacez le média par 500 microlitres de média HIO+ENS chaud de jour. La coculture HIO-ENS a montré une croissance significative avec le développement de structures mésenchymateuses, formant des projections minces et brumeuses, créant une bordure en forme de halo autour des involutions épithéliales au jour 30. Les ENCC ont migré vers les HIO, se sont intégrés dans le mésenchyme et ont survécu in vitro, comme le montre la fluorescence de la GFP dans les HIO, confirmant des signaux de survie et de différenciation adéquats du mésenchyme.Les cocultures HIO+ENS transplantées ont exprimé des marqueurs neuronaux, y compris HuCD, et des marqueurs gliaux tels que S100 bêta après croissance in vivo, confirmant la différenciation en neurones et en glie.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo démontre la méthode de création d’organoïdes nerveux moteurs en cultivant d’abord des cellules souches pluripotentes induites humaines dans un milieu spécial pour former des sphéroïdes, puis en les différenciant en motoneurones à l’aide d’inhibiteurs spécifiques, et enfin en les cultivant dans une puce microfluidique pour étendre les axones et former des organoïdes nerveux moteurs.

Développement d’organoïdes nerveux moteurs dérivés d’iPSC humains à l’aide d’une puce microfluidique

Ce protocole permet de différencier les cellules pluripotentes humaines en organoïdes intestinaux. Le protocole imite le développement humain normal en différenciant les cellules en une population d’endoderme définitif, d’endoderme de l’intestin postérieur, puis d’épithélium intestinal. Cela rend le protocole adapté à la fois à l’étude du développement intestinal et aux applications de modélisation des maladies.

Génération d’organoïdes intestinaux dérivés de hiPSC pour des applications de modélisation du développement et des maladies

Nous présentons ici deux protocoles qui permettent la modélisation des interactions apicales-spécifiques intestinales. Les monocouches intestinales organoïdes-dérivées et les cultures d’interface air-liquide (ALI) facilitent la génération d’épithélium bien différencié accessible des côtés luminal et basolatéral, tandis que les organoïdes intestinaux inversés à polarité exposent leur côté apical et se présentent à des analyses à haut débit.

Méthodes de culture pour étudier les interactions spécifiques aux apicales à l’aide de modèles organoïdes intestinaux

Ici, des méthodes détaillées pour générer, maintenir et caractériser des organoïdes de l’intestin grêle et du côlon dérivés de cellules souches pluripotentes humaines sont décrites. Ces méthodes sont conçues pour améliorer la reproductibilité, étendre l’évolutivité et réduire le temps de travail nécessaire au placage et au passage des organoïdes.

Génération, maintenance et caractérisation d’organoïdes intestinaux et coliques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole offre des instructions détaillées pour établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, isoler les cellules lymphoïdes innées de type 1 de la lamina propria de l’intestin grêle murin et établir des co-cultures en 3 dimensions (3D) entre les deux types de cellules pour étudier les interactions bidirectionnelles entre les cellules épithéliales intestinales et les cellules lymphoïdes innées de type 1.

Co-culture d’organoïdes épithéliaux murins de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées

Les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et les technologies d’organes sur puce sont combinés dans une plate-forme microphysiologique pour récapituler la fonctionnalité intestinale spécifique à la région.

Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale

Nous présentons ici un protocole permettant de générer des organoïdes intestinaux de rat et de les utiliser dans plusieurs applications en aval. Les rats sont souvent un modèle préclinique privilégié, et le système organoïde intestinal robuste répond au besoin d’un système in vitro pour accompagner les études in vivo .

Génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat

Le protocole combine la technologie des organoïdes intestinaux humains avec l’analyse transcriptomique d’une seule cellule pour fournir des informations significatives sur la biologie intestinale jusqu’alors inexplorée.

Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule

Cette étude décrit un protocole pour générer des monocouches 2D d’organoïdes porcins dérivés de l’intestin grêle et du gros intestin. La croissance de ces monocouches est marquée par l’augmentation des valeurs TEER, indiquant une intégrité épithéliale robuste. De plus, ces monocouches présentent des réponses sécrétoires physiologiques dans les expériences en chambre d’Ussing après l’application de forskoline.

Organoïdes intestinaux porcins bidimensionnels reflétant les propriétés physiologiques de l’intestin natif

La modélisation du développement du cerveau humain a été entravée en raison de la complexité sans précédent du tissu épithélial neural. Ici, une méthode de génération robuste d’organoïdes cérébraux pour délimiter les événements précoces du développement du cerveau humain et modéliser la microcéphalie in vitro est décrite.

Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce

Découvrez l'innervation des organoïdes intestinaux humains pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode intègre le système nerveux entérique pour améliorer la fonctionnalité et offrir des solutions thérapeutiques aux enfants atteints d'insuffisance intestinale.

Innervation des organoïdes intestinaux humains

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