Name: Détection de la bulle nucléaire et de la fuite d’ADN dans les cellules de mammifères par immunofluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Découvrez la détection de la bulle nucléaire et de la fuite d'ADN par immunofluorescence dans les cellules HeLa. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de réparation de l'ADN dans les laminopathies comme le syndrome de Hutchinson-Gilford.

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<ol><li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ZMPSTE24+%28FACE1%29+mutations+in+patients+affected+with+restrictive+dermopathy+or+related+progeroid+syndromes+and+mutation+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update.</a> Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).</li>
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<li>Goldman, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mutant+lamin+A+causes+progressive+changes+in+nuclear+architecture+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).</li>
<li>Eriksson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+de+novo+point+mutations+in+lamin+A+cause+Hutchinson%E2%80%93Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome.</a> Nature. 423, 293-298 (2003).</li>
<li>Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+Lipid+post-translational+modifications.+Prelamin+A%2C+Zmpste24%2C+misshapen+cell+nuclei%2C+and+progeria%E2%80%94new+evidence+suggesting+that+protein+farnesylation+could+be+important+for+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis.</a> J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).</li>
<li>Worman, H. J., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+and+ZMPSTE24+in+premature+and+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging.</a> Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Pande, S., Ghosh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteostasis+imbalance+in+laminopathy-associated+premature+aging+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases.</a> FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).</li>
<li>Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+enzyme+immunomicroscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods.</a> J Immunoassay Immunochem. 21 (2-3), 235-253 (2000).</li>
<li>Tjaden, A., Giessmann, R. T., Knapp, S., Schroder, M., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+live-cell+multiplex+screen+for+chemogenomic+compound+annotation+based+on+nuclear+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-content live-cell multiplex screen for chemogenomic compound annotation based on nuclear morphology.</a> STAR Protoc. 3 (101791), 1-15 (2022).</li>
<li>Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+screen+reveals+new+regulators+of+nuclear+membrane+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability.</a> Sci Rep. 14, 6013(2024).</li>
<li>Yu, L., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+DNA+sensing+by+cGAS%3A+Regulation%2C+function%2C+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).</li>
<li>Odinammadu, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+%28FTI%29+lonafarnib+improves+nuclear+morphology+in+ZMPSTE24-deficient+fibroblasts+from+patients+with+the+progeroid+disorder+MAD-B%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B.</a> Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).</li>
</ol>

La lame nucléaire est un réseau de filaments qui sous-tend la membrane nucléaire et est composé de protéines appelées lamines. La lame nucléaire joue un rôle essentiel dans l’architecture nucléaire, le positionnement des pores nucléaires, la régulation de l’expression des gènes, l’organisation de la chromatine, la réplication de l’ADN et la réparation de l’ADN 1,2,3. Des mutations dans des gènes qui jouent un rôle dans l’expression des protéines du lamin entraînent des troubles génétiques appelés laminopathies3.
La dermopathie restrictive (DR) est une laminopathie sévère causée principalement par des mutations hétérozygotes composées qui créent des codons de terminaison prématurée dans le gèneZMPSTE24 4, conduisant à une absence de métalloprotéase ZMPSTE24. Cette laminopathie se caractérise par un retard de croissance intra-utérin, une peau tendue et rigide, une bouche de petite taille, des poils fins et des défauts de minéralisation osseuse1. Les patients atteints de DR ne survivent généralement pas au-delà de leur première semaine de vie en raison de l’insuffisance pulmonaire1. Deux autres troubles de la laminopathie connus sous le nom de syndrome de progeria atypique de Hutchinson-Gilford (AT-HGPS) et de dysplasie mandibulo-acrale de type B (MAD-B) impliquent une expression réduite de la ZMPSTE24 et sont associés à une durée de vie réduite et présentent des similitudes avec les troubles du vieillissement prématuré5. La protéase ZMPSTE24 qui est impactée dans ces laminopathies est vitale dans la modification post-traductionnelle de la lamine A, qui est un composant essentiel de la lame nucléaire. ZMPSTE24 carence entraîne l’accumulation d’une forme farnésylée incomplètement traitée de la lamine A, connue sous le nom de prélamine A2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig1.jpg"> 
Figure 1 : Traitement de la lamine A dans les environnements normaux vs. Cellules RD. Voie de traitement de la lamine A dans les cellules normales (à gauche) et traitement de la lamine A altérée dans les cellules déficientes en RD ou ZMPSTE (à droite). Les groupes Farnésyle (Fa) et méthyle (Me) sont indiqués. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67719/67719fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Comme le montre la figure 1, dans le traitement normal de la lamine A, un groupe farnésyle (lipide) est attaché à un résidu cystéine près de l’extrémité C-terminale, suivi d’un clivage protéolytique de trois acides aminés C-terminaux 3,6. Le résidu cystéine est ensuite méthylé. Ces deux modifications permettent au prélamin A d’être ciblé sur la membrane nucléaire interne2. ZMPSTE24 effectue ensuite une réaction de clivage par laquelle les 15 derniers acides aminés C-terminaux, ainsi que les groupes farnésyle et méthyle, sont éliminés pour produire la protéine Lamin A mature, qui est délivrée à la lame nucléaire 6,7,8. Dans RD, AT-HGPS et MAD-B, l’étape finale du traitement ne se déroule pas efficacement car la métalloprotéinase ZMPSTE24 est absente ou n’est pas entièrement fonctionnelle 8,9. Il en résulte l’accumulation de prélamine A, qui reste en permanence farnésylée et méthylée9. Ces derniers groupes font que le prélamin A adhère à la membrane nucléaire interne au lieu de se localiser dans le limbe nucléaire, où le lamin A mature devrait finalement résider, comme le montre la figure 1. Ainsi, la déficience de ZMPSTE a des effets profonds sur une variété de fonctions nucléaires, ainsi que sur la structure nucléaire10,11,12,13,14,15. Ces altérations de la structure nucléaire peuvent inclure des bulles nucléaires et même des ruptures nucléaires qui peuvent entraîner la fuite d’ADN dans le cytosol ainsi que l’entrée de cytosol dans le noyau. Les noyaux de forme aberrante sont en effet une caractéristique des troubles de la laminopathie, ainsi que de nombreux autres phénotypes causés par un traitement défectueux de la prélamine A16,17. Les défauts de la lame nucléaire entraînent une multitude d’impacts néfastes, notamment la mauvaise localisation des protéines nucléaires, le contrôle de la qualité des protéines nucléaires et les protéines de réparation de l’ADN dans le nucléoplasme, ce qui, à son tour, entraîne de nombreux défauts de la fonction nucléaire18. Il est important de disposer d’une technique simple qui puisse aider à identifier et à surveiller ces caractéristiques des laminopathies afin de faciliter la recherche dans le développement d’approches thérapeutiques visant à améliorer les phénotypes de la laminopathie. Pour les souris atteintes de laminopathies, il a été démontré que l’élimination du bulle nucléaire est corrélée à l’élimination généralisée des phénotypes de laminopathie16. Une technique qui permet de surveiller l’intégrité nucléaire dans les cellules humaines pourrait améliorer l’étude des traitements potentiels pour éliminer ou améliorer considérablement les phénotypes de la maladie.
L’immunofluorescence indirecte (FI) est une technique sensible et largement utilisée qui utilise à la fois un anticorps primaire non marqué et un anticorps secondaire marqué au fluorophore qui reconnaît l’anticorps primaire pour détecter une cible d’intérêt19. Les méthodes FI peuvent fournir un moyen puissant de visualiser des composants et des structures intracellulaires spécifiques. Il est également possible que plus d’une molécule d’anticorps secondaire interagisse avec l’anticorps primaire, entraînant une amplification du signal19. La FI indirecte est une technique polyvalente qui permet également de détecter plusieurs anticorps primaires avec un ensemble relativement petit d’anticorps secondaires, car les anticorps secondaires sont élevés contre le domaine Fc de l’anticorps primaire, qui est conservé au sein de l’espèce19.
Cet article décrit une méthode indirecte (FI) pour évaluer le gonflement nucléaire et la fuite d’ADN dans les cellules déficientes en ZMPSTE24, en utilisant des anticorps contre l’ADN double brin (ADNdb) et la lamine B1 pour détecter l’ADN et la lame nucléaire, respectivement. Pour démontrer l’utilité de cette approche, la procédure a été appliquée à une lignée cellulaire HeLa avec une expression ZMPSTE24 knock-out, ainsi qu’à une lignée cellulaire HeLa qui exprime ZMPSTE24, et les résultats des deux lignées cellulaires ont été comparés.

<table><tbody><tr><td>Lamelles de protection en verre carré de 22 mm</td><td>Propper Manufacturing Company</td><td>M8710 N’importe</td><td>quelle taille ou forme peut être utilisée tant qu’elles peuvent être fixées à une lame de microscope standard.</td></tr><tr><td>36,5 % de formaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>réactif de fixation.</td></tr><tr><td>75 cm 2 Flacons</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td>Pour la culture cellulaire.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum bovin Albinum (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td>Tampon de dilution d’anticorps.&nbsp ;</td></tr><tr><td>DMEM avec 1 g/L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td>Pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Éthanol (200 proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>Pour la déshydratation des échantillons avant le montage, dilué pour obtenir des concentrations multiples.</td></tr><tr><td>EVOS FL Microscope numérique à fluorescence inversée</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-460</td><td>Imagerie.</td></tr><tr><td>Gélatine de poisson</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>Tampon de dilution d’anticorps.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Support de montage pour éviter le photoblanchiment.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Parafilm (4 po)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>N’importe quelle taille peut être remplacée, à condition que les lamelles utilisées puissent s’adapter.</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fabriqué et stérilisé en laboratoire pour la culture tissulaire et les solutions.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin de qualité supérieure (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Lames de microscope Superfrost Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td>N’importe quelle lame de microscope standard peut être utilisée.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaques à fond plat 6 puits traitées pour la culture</td><td>tissulaire Falcon</td><td>353046</td><td>pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A16046. AP</td><td>Pour le lavage.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5 %)</td><td>Gibco</td><td>15-400-054</td><td>Pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>9005-64-5</td><td>Réactif de perméation cellulaire.</td></tr></tbody></table>

détection de la bulle nucléaire et de la fuite d’adn dans les cellules de mammifères par immunofluorescence

Detection of Nuclear Blebbing and DNA Leakage in Mammalian Cells by Immunofluorescence

Cette étude introduit une méthode IF pour visualiser la lame nucléaire en conjonction avec l’ADN double brin (ADNdb). Une fois l’IF effectuée, les images capturées peuvent être examinées à la recherche de signes de décoloration nucléaire et de fuite d’ADN.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig2.jpg"> 
Figure 2 : Bulle nucléaire dans les cellules HeLa CT...

Détection de la bulle nucléaire et de la fuite d’ADN dans les cellules de mammifères par immunofluorescence

The nuclear lamina is a network of filaments underlying the nuclear membrane, composed of lamins and lamin-associated proteins. It plays critical roles in ...

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Biologie

Procédé d'observation des molécules d'ADN dans des cellules vivantes individuelles est décrit. La technique est basée sur la liaison d'une protéine répresseur lac marqué par fluorescence à des sites de liaison d'ingénierie dans l'ADN d'intérêt. Ce procédé peut être adapté pour suivre plusieurs ADNs recombinants dans des cellules vivantes dans le temps.

Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

Dans cette vidéo, nous décrivons la méthode d’immunofluorescence pour visualiser la localisation des protéines de réparation de l’ADN γH2AX et 53BP1 aux sites de cassures d’ADN double brin dans les noyaux cellulaires irradiés.

Visualisation par immunofluorescence des interactions entre les protéines de réparation de l’ADN

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de microscopie par immunofluorescence pour détecter des protéines spécifiques de réponse aux dommages de l’ADN localisées sur les sites de cassures double brin de l’ADN dans les cellules mononucléées humaines. Les protéines sont reconnues par des anticorps primaires spécifiques, qui à leur tour se lient à des anticorps secondaires marqués au fluorophore qui deviennent fluorescents lors de la visualisation microscopique, permettant de visualiser les...

Microscopie d’immunofluorescence pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN

Ce manuscrit décrit une nouvelle technique qui permet la détection de l’expression génique intracellulaire après endocytose de nanoparticules marquées par fluorescence directement dans des cellules vivantes. La méthode ne nécessite pas de manipulation des cellules et n’est pas limitée par rapport au gène ou à l’espèce cible.

Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité

Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Confocal fluorescence microscopie et laser micro-irradiation offre des outils pour induisant des dommages à l’ADN et le suivi de la réponse des protéines de réparation d’ADN dans certaines zones Sub nucléaires. Cette technique a grandement avancer nos connaissances sur la détection des dommages causés, de signalisation et de recrutement. Ce manuscrit montre ces technologies afin d’examiner la réparation de rupture de brins simples et doubles.

Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

Imagerie de cellules vivantes fournit une foule de renseignements sur des cellules individuelles ou des populations entières qui est inaccessible par cellule fixe d’images seul. Ici, les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique sont décrits.

À long terme vivre-cellule d’imagerie afin d’évaluer le sort de la cellule en réponse au Paclitaxel

Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence

La réponse aux dommages causés par l’ADN par rayonnement activé par le faisceau mixte de neutrons utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT) n’a pas été entièrement établie. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour détecter les foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence dans les lignées cellulaires du cancer du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.

Imagerie d’immunofluorescence des dommages d’ADN et des foyers de réparation dans les cellules cancéreuses du côlon humain

Dans le présent protocole, nous montrons comment visualiser la résection de l’extrémité double brin de l’ADN pendant la phase S/G2 du cycle cellulaire à l’aide d’une méthode basée sur l’immunofluorescence.

Évaluation de la résection finale globale de l’ADN double brin à l’aide du marquage BrdU-ADN couplé à l’imagerie de discrimination du cycle cellulaire

Découvrez la détection de la bulle nucléaire et de la fuite d'ADN par immunofluorescence dans les cellules HeLa. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de réparation de l'ADN dans les laminopathies comme le syndrome de Hutchinson-Gilford.

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