In vitro Test de thrombose pour les dispositifs d’assistance ventriculaire

Nous présentons un protocole de paillasse pour induire une thrombose dans des dispositifs d’assistance ventriculaire (DAV) au sein d’une plate-forme de test en recirculation. Cette méthode sert à identifier les points chauds thrombogènes dans le flux sanguin et peut aider à améliorer la thromborésistance avant les tests précliniques sur des modèles animaux.

Notre objectif est de développer un protocole de paillasse pratique et accessible pour identifier les points chauds thrombogènes potentiels dans les dispositifs d’assistance ventriculaire, comblant ainsi le fossé critique entre le prototypage précoce et les tests sur les animaux. L’expérimentation animale est restée la principale méthode d’évaluation de la thrombose dans les dispositifs d’assistance ventriculaire. Bien que la dynamique des fluides numérique soit devenue un outil inestimable pour la vérification de la conception, elle ne peut pas encore supplanter la validation in vitro et in vivo.

La nature complexe de la présence de coagulation sanguine et de nombreux facteurs de confusion rendent difficile la distinction entre la thrombogénicité réelle du dispositif et les artefacts expérimentaux. Les méthodes in vitro d’évaluation de la thrombose dans les DAV restent sous-utilisées et il n’existe à ce jour aucune méthode standardisée. En proposant un protocole complet et un guide vidéo, nous espérons faciliter une adoption plus large des méthodes de paillasse.

Cette méthode répond à un défi à la fois technique et éthique dans le développement de dispositifs médicaux, en réduisant le recours aux tests sur les animaux, tout en améliorant la capacité à détecter les risques de thrombose dès le début du processus de développement. Pour commencer, remplissez la boucle de test avec 150 millilitres de sang. Éliminez tout l’air emprisonné dans la boucle.

Si vous utilisez une pompe sanguine à flux axial, tournez-la en position verticale pour libérer l’air par flottabilité. Si vous utilisez une pompe centrifuge, retournez-la et faites-la pivoter pour vous assurer qu’aucun air n’est emprisonné dans les voies d’écoulement secondaires. Tapotez doucement les surfaces du tube et du réservoir et pressez les bulles d’air pour les déloger.

Inspectez de près les sections horizontales des tubes et les jonctions entre les tubes et les connecteurs pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air. Pressez le sac intraveineux pour amener le niveau de liquide près de la partie supérieure étroite. Ensuite, fixez le sac avec un hémostat sur la conduite de fluide pour éliminer l’interface fluide-air, et fermez le robinet d’arrêt de la bouche d’aération.

Ensuite, fermez le robinet d’arrêt à l’extrémité des conduites de pression. Retirez la tubulure du manomètre et fixez-y une seringue de trois millilitres. Ouvrez le robinet d’arrêt et aspirez un à deux millilitres de liquide dans la ligne d’extension, soit environ quatre centimètres.

Fermez le robinet d’arrêt, détachez la seringue et reconnectez le tube du manomètre. Ouvrez le robinet d’arrêt pour activer les lectures de pression. Enfin, amorcez l’orifice d’échantillonnage à l’aide d’une seringue.

Ensuite, coupez ou déchirez une lingette non pelucheuse en trois fragments égaux. Tournez le coin d’un fragment pour former une pointe et insérez-le dans l’orifice d’injection pour absorber le sang résiduel. Tournez le deuxième fragment.

Humidifiez-le avec une solution saline et insérez l’embout humide dans l’orifice pour éliminer tout le sang restant. Utilisez le troisième fragment pour absorber toute solution saline résiduelle dans le port. Démarrez maintenant le dispositif d’assistance ventriculaire, ou VAD, à basse vitesse et faites-le fonctionner pendant environ cinq secondes pour déloger toutes les bulles d’air piégées dans la pompe.

Arrêtez la pompe. Si des bulles apparaissent dans le sac, répétez le désaérage. Redémarrez la pompe à basse vitesse pour faire circuler le sang dans la boucle.

Transférez un millilitre d’héparine sodique, deux millilitres de la solution de chlorure de calcium préparée et 1,5 millilitre d’EDTA dans des tubes séparés. Pour ajouter de l’héparine au sang dans l’anse, aspirez 75 unités d’héparine dans une micropipette et distribuez-la dans une seringue de trois millilitres en distribuant simultanément la pipette et en tirant le piston de la seringue sans renverser. Utilisez l’orifice transversal du robinet d’arrêt à trois voies pour administrer des substances dans la boucle à l’aide d’une seringue.

Tournez le verrou du leurre mâle sur le robinet d’arrêt de sorte que l’orifice d’injection soit orienté vers le haut pour piéger les bulles d’air en haut. Fixez maintenant la seringue à l’orifice d’injection via le verrou de leurre, l’orifice vers le haut et la seringue pointant verticalement vers le bas. Tirez le piston de la seringue pour le remplir de sang et mélangez l’héparine avec le sang tout en aspirant de l’air dans la seringue.

Laissez les bulles d’air remonter vers le haut de la seringue. Injectez ensuite le mélange dans la boucle en veillant à ce qu’aucun air n’entre. Faites entrer et sortir le sang de la seringue quatre à cinq fois pour vous assurer que le sang hépariné ne reste pas confiné à l’espace dans l’orifice.

Pour titrer le temps de coagulation activé, ou ACT, du sang dans la boucle, ajoutez d’abord 750 microlitres de solution de chlorure de calcium à une molaire à 150 millilitres de sang dans la boucle. Pour prévenir la coagulation sanguine, injectez rapidement le liquide après avoir éliminé l’air résiduel. Alternativement, diluez le chlorure de calcium dans la seringue avec un millilitre de solution saline tri-tamponnée pour réduire la coagulation prématurée.

Après avoir laissé circuler le chlorure de calcium injecté pendant au moins deux minutes, fixez une seringue d’un millilitre à l’orifice de prélèvement. Prélevez et jetez 0,5 millilitre de sang perdu pour éliminer le sang stagnant de l’orifice. Ensuite, fixez une nouvelle seringue d’un millilitre à l’orifice d’échantillonnage et prélevez 0,5 millilitre de sang pour l’analyse.

Mesurez le temps de coagulation activé à l’aide d’un système de coagulation du sang entier au point de service. Nettoyez l’orifice d’échantillonnage à l’aide de lingettes non pelucheuses comme indiqué précédemment. Reportez-vous aux valeurs de titrage pour informer la concentration cible de chlorure de calcium.

Augmentez progressivement la concentration de calcium pour obtenir un temps de coagulation activé de 300 secondes. Commencer le test de thrombose in vitro une fois que l’ACT de 300 secondes est atteint dans la boucle. Ajustez la pompe au débit et à la pression souhaités en modifiant la vitesse du rotor et en régulant la résistance à l’aide de la pince Hoffman.

Mesurez l’ACT toutes les 15 minutes en prélevant un échantillon de sang dans l’anse et en plaçant une goutte de sang dans l’instrument ACT, comme démontré précédemment. Si l’ACT tombe en dessous de 200 secondes, injectez 25 unités supplémentaires d’héparine sodique dans la boucle. Après une heure, injectez 1,5 millilitre d’EDTA 0,5 molaire dans l’anse pour inhiber la coagulation.

Laissez l’EDTA circuler et mélanger pendant deux minutes, puis arrêtez la pompe. À l’aide d’hémostats, clampez le tube relié à l’entrée et à la sortie de la pompe, en positionnant les pinces à trois ou quatre centimètres des ardillons d’entrée et de sortie. Débranchez soigneusement le tube pour libérer la pompe.

Videz ensuite le sang de la pompe et de la boucle d’écoulement dans un récipient. Enfin, pipetez une solution saline à travers l’entrée et la sortie de la pompe pour laver tout sang résiduel. Le dépôt de plaquettes a été observé de manière constante le long des racines des pales dans les prototypes de pompes.

L’électropolissage des composants en titane a éliminé la formation de thrombus sur ces zones. Le prototype avait également une cooptation imparfaite dans la jonction des composants du boîtier avant et arrière, ce qui entraînait une crevasse où le sang s’infiltrait et coagulait. Le rodage et le polissage ont amélioré l’ajustement des composants et réduit la formation de thrombus.

Des erreurs de procédure et une désaération incomplète de la boucle peuvent introduire des artefacts. Dans ce cas, une erreur expérimentale lors de l’injection de chlorure de calcium a déclenché une coagulation localisée, et le thrombus résultant a pénétré dans la pompe centrifuge Maglev, obstruant la voie d’écoulement. Les caillots sphériques et faiblement adhérents observés sur les surfaces sont souvent le résultat de bulles d’air encapsulées dans des caillots.

Les corps étrangers et les débris circulant dans l’anse ont également été encapsulés dans des thrombus et ont adhéré aux surfaces de la pompe. Les thrombus annulaires aux jonctions des connecteurs de tubes étaient indicatifs d’une plage ACT optimale pendant l’essai.