Édition du génome du moustique de la fièvre jaune Aedes aegypti à l’aide de CRISPR-Cas9

Nous décrivons ici un protocole détaillé d’édition du génome par micro-injection embryonnaire chez le moustique A. aegypti à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9.

La portée de notre recherche consiste à établir des lignées de moustiques génétiquement modifiées à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. L’utilisation de la technologie CRISPR-Cas9 pour la suppression des populations de moustiques, PgSIT, ainsi que pour la mise en place des systèmes d’expression binaire pour le contrôle temporel spatial de l’expression des gènes.

Nous avons obtenu des lignes d’éjection et de renversement en utilisant la technologie CRISPR-Cas9. Nos lignées de knockin comprennent l’insertion du transactivateur QF qui permet le contrôle temporel spatial des gènes en aval, tels que les marqueurs fluorescents, la GFP, pour le marquage spécifique des tissus et les rapporteurs de l’activité neuronale, G-CaMP6.

L’établissement de nouvelles lignées de moustiques mutants permettra de mieux comprendre la fonction des gènes et les implications nerveuses, physiologiques et comportementales. Cela pourrait conduire à la mise au point de nouvelles méthodes pour prévenir la transmission de maladies transmises par les moustiques. Notre laboratoire a mis au point une technologie de suppression de la population de moustiques qui s’appuie sur la technologie CRISPR-Cas9 pour éliminer les gènes liés à la fertilité masculine et à la viabilité féminine. De plus, nous avons établi plusieurs lignées de moustiques pour l’étude de la résistance sensorielle des moustiques, en particulier l’olfaction et la vision.

[Intervieweur] Pour préparer la construction d’injection pour les mutants knock-out, diluez la protéine Cas9 à la concentration souhaitée à l’aide du tampon de dilution Cas9. Diluez ensuite l’aliquote d’ARN guide synthétisé in vitro ou d’ARNg avec de l’eau ultrapure. Prémélangez la protéine Cas9 diluée avec chaque ARNg pour former un complexe ribonucléoprotéique. Combinez ensuite les multiples solutions complexes de ribonucléoprotéines prémélangées. Pour les insertions de cassette de gènes médiées par réparation dirigée par homologie, diluez et mélangez la protéine Cas9 et les ARNg. Diluez le plasmide donneur avec de l’eau ultrapure et combinez toutes les constructions. Ensuite, utilisez un filament de quartz pour préparer les aiguilles de micro-injection. À l’aide du programme suivant. Tirez les aiguilles à l’aide d’un extracteur de micropipette laser. Après avoir installé un aspirateur manuel, humidifiez les papiers filtres à cercle blanc et placez-les soit sur la paroi intérieure, soit sur du coton humide à l’intérieur du collecteur. Placez cinq à dix moustiques femelles qui ont été nourries de sang il y a cinq à dix jours dans le collecteur. Placez ensuite le collecteur dans l’obscurité pendant 45 minutes. Ensuite, retirez les moustiques du collecteur. Après l’incubation, retirez les papiers-filtres pour récolter les embryons. Sélectionnez des embryons au stade pré-blastoderme qui sont gris clair sur le papier de récolte. Transférez les embryons sélectionnés avec une brosse humide sur du ruban adhésif double face placé sur une lamelle. Alignez les embryons en parallèle, en vous assurant qu’ils sont côte à côte, toutes les extrémités postérieures faisant face à l’avant tandis que leur entourage reste humide. Pendant l’alignement, ajoutez de l’huile d’halocarbure 700 sur les embryons pour éviter la dessiccation. Sur le micro-injecteur, mettez en place une pression de compensation de 300 hectopascals et une pression d’injection de 500 hectopascals. À l’aide d’un micro-chargeur, chargez trois microlitres de la construction d’injection dans une aiguille. Placez la lamelle avec les embryons alignés sur une lame de microscope et placez-la sous le microscope pour l’injection. Ensuite, fixez une aiguille dans le porte-aiguille à l’aide d’un micro-manipulateur à un angle de 10 degrés vers l’extrémité postérieure des embryons. Ouvrez l’aiguille doucement en touchant légèrement sa pointe au bord de la lamelle. Injectez ensuite dans l’embryon la construction plasmidique. Après avoir injecté des moustiques Aedes agyptie avec un produit d’injection, utilisez des lingettes jetables non pelucheuses pour enlever l’huile entourant les embryons. Ajoutez de l’eau déminéralisée pour rincer les embryons. Transférez les embryons rincés sur un papier filtre humide et placez le papier filtre sur un mouchoir humide à l’intérieur d’une tasse de neuf onces de carat. Placez ensuite du coton humide au fond du bonnet pour maintenir l’humidité. Après avoir gardé les embryons humides pendant trois à quatre jours, transférez le papier filtre avec les embryons dans environ trois litres d’eau déminéralisée dans une casserole Sterilite de six pintes pour l’éclosion. Une fois que les larves G zéro éclosent, ajoutez de la nourriture pour poissons mélangée à de l’eau dans la casserole. Criblez les larves G zéro pour le marqueur fluorescent au troisième ou au quatrième stade larvaire. Séparez les larves en fonction de leur statut fluorescent. Conservez les larves fluorescentes positives et fluorescentes négatives dans des bacs séparés. Séparez les moustiques injectés par sexe lorsqu’ils se nymphosent et identifiez les mâles par leur petite taille, leur lobe génital plus proéminent et pointu et leurs palettes plus larges. Identifiez les femelles par leur grande taille, leur lobe génital moins prononcé et leurs pagaies plus étroites. Après avoir regroupé des moustiques fluorescents positifs ou négatifs fluorescents de chaque sexe, croisez chaque bassin avec des moustiques du sexe opposé de la souche sauvage Liverpool A. agyptie dans un rapport de trois à cinq individus de type sauvage pour chaque individu soumis à un dépistage fluorescent, ce qui leur permet de s’accoupler pendant quatre jours. Après trois à quatre jours, dépister les larves G1 pour le marqueur fluorescent aux troisième et quatrième stades larvaires.