Name: Purification du réticulum sarco-endoplasmique Ca2+-ATPase du muscle de lapin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Apprenez la purification de la SERCA à partir du muscle de lapin en utilisant un gradient de tréhalose pour stabiliser la protéine. Cette méthode améliorée permet d'obtenir une haute pureté et une activité catalytique optimale pour les études structurales.

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Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives internationales et locales (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) pour la manipulation des animaux dans les laboratoires expérimentaux 51,67,68. Du tissu musculaire a été obtenu à partir d’Oryctolagus cuniculus de type sauvage provenant d’une unité locale de manipulation d’animaux (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. Un vétérinaire spécialisé dans la gestion des animaux de laboratoire a effectué la dissection et le traitement musculaires initiaux. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Isolement du réticulum sarcoplasmique à partir d’un muscle de lapin à contraction rapide (Durée, 7 - 9 h)
REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, voir Champeil et al.69.
<ol>
	<li>Obtenez du tissu musculaire à contraction rapide (~70 g des deux pattes arrière par animal) à partir d’Oryctolagus cuniculus de type sauvage. REMARQUE : L’identification visuelle préalable des muscles à disséquer est requise70,71.</li>
	<li>Faites macérer le muscle à contraction rapide dans un mélangeur en le suspendant en trois volumes de 100 mM de KCl, avec 1 min de marche et 1 min de repos glacé, répétez trois fois72.</li>
	<li>Retirer les débris tissulaires par centrifugation (1500 × g) à 4 °C pendant 5 min ; Une seconde centrifugation (4200 × g) est effectuée si nécessaire.</li>
	<li>Prélever le surnageant et l’homogénéiser à l’aide d’un broyeur à mouchoirs (10 coups à basse vitesse, c’est-à-dire 500-1 500 tr/min)72,73. Centrifuger l’homogénat (10 000 × g) à 4 °C pendant 15 min. REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de l’homogénéisation, car l’utilisation d’une vitesse relativement élevée peut entraîner des dommages au système et à l’opérateur.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant (contenant le réticulum sarcoplasmique) (33 000 × g) à 4 °C pendant 120 min.</li>
	<li>Mettre les pastilles en suspension dans 40 mL de 0,5 M de saccharose et centrifuger (12 000 × g) à 4 °C pendant 15 min. Diluer le surnageant (0,6 M de KCl et 0,15 M de saccharose) et centrifuger la suspension (34 000 × g) à 4 °C pendant 165 min.</li>
	<li>Mettre en suspension la pastille contenant les feuilles de vésicules du réticulum sarcoplasmique (SRV) dans 0,3 M de saccharose, 0,1 M de KCl et 5 mM de Tris-HCl, pH 7,0. Déterminez la concentration en protéines en utilisant le test de Lowry74 et l’albumine sérique humaine comme étalon protéique.</li>
	<li>Aliquote les SRV (30-32 mg/mL) dans un volume de 1 mL. Stockez les échantillons SRV à -72 °C pour un traitement ultérieur. REMARQUE : Le rendement en protéines est de 100 à 110 mg de SRV par animal.</li>
</ol>
2. Purification SERCA (Durée, 18 - 20 h)
REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter Rivera-Morán et al.46.
<ol>
	<li>Diluer la suspension de SRV à 2 mg de protéines/mL en utilisant 75 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 0,6 M de KCl, 6 mM d’EDTA, 1 mM d’EGTA et 0,1 % (p/v) de désoxycholate (COD). Incuber la suspension SRV sur de la glace pendant 10 min et agiter doucement. Centrifuger la suspension SRV (100 000 × g) à 4 °C pendant 60 min. REMARQUE : Le DOC doit être ajouté goutte à goutte.</li>
	<li>Mettre les pastilles en suspension dans &lt;3 mL de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M de KCl, 45 % de glycérol (v/v) et 2 mM d’EDTA. Homogénéiser la suspension et l’ajuster à un volume final de 10 mL. Déterminez la concentration en protéines, puis ajustez-la à 6,5 mg/mL. Ajouter de l’azolectine à 5 mg/mL et 0,85 (p/p) de Zwittergent 3-14. REMARQUE : L’azolectine et le Zwittergent 3-14 doivent être ajoutés goutte à goutte.</li>
	<li>Homogénéiser la suspension et centrifuger (100 000 × g) à 4 °C pendant 60 min. Prélever le surnageant et diluer 1:2 avec 2 mM d’EGTA (pH 7,2).</li>
	<li>Verser délicatement la suspension sur un gradient discontinu de concentration de tréhalose (45, 40, 35 et 30 % p/v) dans 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM d’EDTA, 0,1 % de désoxycholate et 1 mg/mL d’azolectine. Centrifugeuse (100 000 × g) à 4 °C pendant 14 h. Récupérez la pastille transparente, légèrement jaunâtre, formée au fond des tubes. REMARQUE : La formation du gradient de tréhalose et l’ajout de la suspension de l’échantillon doivent être effectués à l’aide de techniques appropriées. Une centrifugation de nuit est recommandée.</li>
	<li>Suspendre doucement la pastille dans un petit volume (&lt;1,5 mL) de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 de M KCl, 45 % de glycérol et 2 mM d’EDTA. Déterminer la concentration en protéines. Ajuster la concentration en protéines par dilution à 2 mg/mL. Prélever des aliquotes (~50 μL) de la suspension et stocker le SERCA purifié à -72 °C jusqu’à son utilisation.</li>
	<li>Réaliser la fiche de données de sécurité du SERCA72 purifié, et des échantillons de protéines prélevés aux différentes étapes de la purification. Teignez le gel avec Coomassie Blue72. REMARQUE : L’utilisation de 0,6 M de tréhalose au lieu de glycérol dans le tampon de suspension augmente la stabilité de l’enzyme pendant le stockage et les cycles de congélation-décongélation28,29.</li>
</ol>
3. Dosage de l’activité ATPase (Timing, 1 - 2 h)
<ol>
	<li>Dosage enzymatique : ATPase-Piruvate kinase-lactate déshydrogénase<ol>
		<li>Préparez le mélange réactionnel (1 mL) : 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM de phosphoénolpyruvate, 250 μM de NADH. Inclure des concentrations variables d’ATP (0,001 à 0,25 mM).</li>
		<li>Homogénéiser soigneusement le test de réaction par vortex. Incuber le test de réaction à 37 °C pendant 10 min. Ajouter 0,9 U de L-lactate déshydrogénase (LDH) et 1,5 U de pyruvate kinase (PK).</li>
		<li>Initier la réaction ATPase par l’ajout de 10 μg de SERCA.</li>
		<li>Déterminer la formation du NADH. Suivez l’évolution de l’intensité de l’absorbance toutes les secondes pendant 600 s à une longueur d’onde (λ) de 340 nm au fil du temps à l’aide d’un spectrophotomètre muni d’un support de cellule thermostaté. REMARQUE : L’intervalle de temps pour la mesure de l’absorbance peut varier, mais essayez d’enregistrer autant de points de données que possible pour tracer la ligne droite initiale de la réaction ATPase.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Déterminer le taux d’hydrolyse de l’ATP REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter Rivera-Morán et al.46.<ol>
		<li>Calculez la valeur de la pente (Δabs/min) de la portion linéaire dans chaque courbe formée. Utilisez le coefficient d’extinction molaire (ε) du NADH (λ = 6 220 M−1·cm−1) pour déterminer l’activité de l’ATPase (μmoles ATP hydrolysées/min.mg prot.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Déterminer les paramètres cinétiques K,m et Vmax.
	<ol>
		<li>Tracez les données de vitesse en fonction de la concentration d’ATP à l’aide d’un logiciel d’analyse de données et de graphiques.</li>
		<li>Ajustez les données par régression non linéaire à l’équation de Michaelis-Menten (équation 1)46 : 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67748/67748eq01.jpg" style="margin: auto;"> où v est la vitesse, Vmax est la vitesse maximale, [S] est la concentration d’ATP et Km est la constante de Michaelis-Menten.</li>
		<li>Déterminez K,m et Vmax par itération. REMARQUE : L’inclusion de DOC peut augmenter la réponse du taux d’ATPase ; il est recommandé de tester différentes concentrations de COD pour trouver l’optimum.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test de marquage de SERCA avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (Timing, 30 - 45 min, uniquement pour le marquage FITC)
REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, reportez-vous à 54,75,76.
<ol>
	<li>Mettre en suspension SERCA (20 μg) dans 50 μL (volume final) de tampon d’étiquetage (100 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 et 30 mM de Tris-HCl, pH 8,9) contenant 1 mM de FITC. Mélanger par vortex.</li>
	<li>Incuber les échantillons à différents moments (15 min, 10 min, 7 min, 5 min et 2 min) dans l’obscurité et à température ambiante.</li>
	<li>Arrêtez la réaction de marquage en ajoutant 1 volume de tampon d’arrêt glacé (480 mM de saccharose et 48 mM de MOPS, pH 7,0), contenant de l’ATP (5 mM). Incuber sur glace pendant 5 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Soumettre le SERCA labellisé FITC à la FDS-PAGE72. Exposez les gels transparents à la lumière UV (λ = 302 nm). Documentez le résultat avec une photo.</li>
	<li>Teindre le gel avec du bleu Coomassie. Documentez le résultat avec une photo. REMARQUE : L’exécution du marquage FITC dans une pièce sombre peut améliorer la qualité du signal de fluorescence.</li>
</ol>
5. Spectres de dichroïsme circulaire (CD) (Timing, 30 min)
REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, reportez-vous à11,77.
<ol>
	<li>Suspendre SERCA (3 μM) dans 400 μL de tampon phosphate 10 mM (pH 7,0) à 25 °C.</li>
	<li>Chargez l’échantillon dans une cellule de 0,1 cm de longueur de trajet. Réglez la plage λ des spectres UV lointains entre 190 et 260 nm. Réglez la résolution interne et la bande passante sur 1 nm.</li>
	<li>Enregistrez le signal CD à 50 nm/min à 25 °C.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Azolectine de soja</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>44924</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur UV de paillasse&nbsp ;</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-97623-08</td><td>Le réglage haute à double intensité est idéal pour la documentation analytique. Le réglage bas réduit le photonicking ou le photoblanchiment des échantillons de gel pendant le travail de préparation.</td></tr><tr><td>CaCl2 &bull ; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Coolpix B500 camera&nbsp ;</td><td>Nikon Corp</td><td>S210</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie bleu brillant G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610406</td><td></td></tr><tr><td>Dodécyl maltoside</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther )-N,N,N&prime ;,N&prime ; -acide tétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique sel tétrasodique dihydraté&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>Isothiocyanate de fluorescéine</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &bull ; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>230</td><td></td></tr><tr><td>N-tétradecyl-N,N-diméthyl-3-ammonium-1-propanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D0431</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoénolpyruvate (PEP)</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>9711</td><td></td></tr><tr><td>Lactate déshydrogénase musculaire de lapin</td><td>Roche</td><td>10003557103</td><td></td></tr><tr><td>Muscle pyruvate kinase</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td></td></tr><tr><td>Spectropolarimètre&nbsp ;</td><td>Jasco Corp.</td><td>Jasco J1500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Tréhalose</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>T0167</td><td>Chlorhydrate</td></tr> de <tr><td>tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td> dihydraté <td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td> UV/VIS <td>Beckman</td><td>Optima XPN</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Agilent Technologies</td><td>8453</td><td>Le spectrophotomètre UV-Vis Agilent 8453 utilise un réseau de photodiodes pour la mesure simultanée de l’ensemble du spectre de la lumière ultraviolette à la lumière visible</td></tr><tr><td>WiseStir HS- 30E</td><td>Daihan Scientific Co.</td><td>Dh. WOS01010</td><td>Idéal pour toutes les applications de décontamination et d’homogénéisation, conçu pour les broyeurs de tissus.</td></tr></tbody></table>

purification du réticulum sarco-endoplasmique ca2+-atpase du muscle de lapin

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

FDS-PAGE de SERCA à différents stades de purification (Figure 1). Le gel coloré en bleu de Coomassie montre l’enrichissement de la bande protéique SERCA (poids moléculaire apparent &gt;100 kDa) au fur et à mesure de la progression du protocole de purification. La bande protéique correspondant à SERCA présente une pureté de &gt;90 % après centrifugation sur un gradient de concentration de tréhalose. Graphique du taux d’hydrolyse de l’ATP en fonction de la concentration d’ATP (<strong...

Purification du réticulum sarco-endoplasmique Ca2+-ATPase du muscle de lapin

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific ...

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