Purification du réticulum sarco-endoplasmique Ca²⁺-ATPase du muscle de lapin

Notre recherche se concentre sur la purification de SERCA, avec une qualité structurelle et une activité catalytique élevées, tout en cherchant à savoir si le tréhalose stabilise SERCA pendant la purification, améliorant ainsi sa stabilité et sa fonctionnalité. La détermination de la structure tridimensionnelle des ATPases de type P dans leurs états oligomères. L’utilisation de l’intelligence artificielle pour la modélisation structurelle des ATPases, les simulations de dynamique structurelle et l’amarrage moléculaire de ligands afin d’explorer les thérapies contre les maladies et d’améliorer l’analyse de la fonction des protéines et les nouvelles technologies. Les défis actuels comprennent la compréhension des mécanismes de conversion d’énergie dans les P-ATPases, l’élucidation de la façon dont la structure quaternaire régule la fonction et l’activité, et l’identification d’inhibiteurs efficaces pour une application thérapeutique dans les maladies humaines. Nous confirmons l’état hexamérique de la membrane plasmique GS proton-ATPase et démontrons sa dépendance à la dynamique structurelle ou sa viscosité moyenne telle que décrite par la théorie de Kramers.

[Narrateur] Pour commencer, obtenez un muscle à contraction rapide à partir d’Oryctolagus cuniculus de type sauvage. Suspendez-le en trois volumes de chlorure de potassium de 100 millimolaires pour la macération. Mélanger pendant une minute, suivie d’une minute de repos glacé. Centrifugez l’échantillon à 1 500 g à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes pour éliminer les débris tissulaires. Recueillir le surnageant dans un tube, puis l’homogénéiser à l’aide d’un broyeur à tissus. Ensuite, centrifugez l’homogénat, puis le surnageant. Suspendez les granulés dans environ 40 millilitres de saccharose de 0,5 molaire. Maintenant, centrifugez la suspension à 12 000 g à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes. Diluer le surnageant obtenu dans 0,6 molaire de chlorure de potassium et 0,15 molaire de saccharose avant la centrifugation. Suspendre la pastille contenant des feuillets de vésicule de réticulum sarcoplasmique dans un tampon contenant 0,3 molaire de saccharose, 0,1 molaire de chlorure de potassium et 5 millimolaires de tris-chlorhydrate à pH 7,0. Aliquote les vésicules du réticulum sarcoplasmique en volumes de 1 millilitre. Incuber la suspension de la vésicule du réticulum sarcoplasmique sur de la glace pendant 10 minutes en agitant doucement, puis centrifuger. Mettez la pastille en suspension dans moins de 3 millilitres de tampon de chlorhydrate de tris de 25 millimolaires. Après avoir homogénéisé la suspension, ajustez-la à un volume final de 10 millilitres avec un tampon de chlorhydrate de Tris. Déterminer la concentration en protéines à l’aide du test de Lowry. Ajoutez de l’azolectine à 5 milligrammes par millilitre, puis ajoutez 0,85 Zwittergent 3-14. Homogénéiser à nouveau la suspension et centrifuger à 100 000 g à 4 degrés Celsius pendant 60 minutes. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Diluez-le dans un rapport de 1 à 2 avec 2 millimolaires d’EGTA à pH 7,2. Verser doucement la suspension sur un gradient de concentration discontinu de tréhalose dans le tampon Tris. Ensuite, centrifugez comme précédemment et récupérez la pastille transparente et légèrement jaune. Suspendez doucement la pastille dans un petit volume de tampon Tris. Mesurez la concentration en protéines, puis diluez-la pour ajuster la concentration en protéines à 2 milligrammes par millilitre. Pour l’activité ATPase, préparez 1 millilitre du mélange réactionnel. Vortex le test de réaction pour homogénéiser, puis incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter 0,9 unité de L-lactate déshydrogénase et 1,5 unité de pyruvate kinase. Ajoutez 10 microgrammes de SERCA pour initier la réaction ATPase. Surveillez la variation de l’absorbance toutes les secondes pendant 600 secondes à 340 nanomètres avec un spectrophotomètre doté d’un support de cellule thermostatique pour déterminer la formation de NAD. Pour le dosage du marquage du SERCA avec de l’isothiocyanate de fluorescéine, ou FITC, mettez d’abord en suspension 20 microgrammes de SERCA dans 50 microlitres de tampon de marquage. Vortex pour bien mélanger. Ensuite, incubez les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant 15, 10, 7, 5 et 2 minutes. Pour arrêter la réaction d’étiquetage, ajoutez un volume égal de tampon d’arrêt glacé. Incuber sur glace dans l’obscurité pendant 5 minutes. Soumettez le SERCA labellisé FITC à SDS-PAGE. Exposez les gels transparents à la lumière ultraviolette à une longueur d’onde de 302 nanomètres et photodocumentez le résultat. Enfin, colorez le gel avec du bleu Coomassie. Photodocumentez le résultat. Pour l’analyse des spectres de dichroïsme circulaire, suspendez d’abord SERCA dans 400 microlitres de tampon phosphate 10 millimolaires de pH 7,0 à 25 degrés Celsius. Chargez l’échantillon dans une cellule d’une longueur de trajet de 0,1 centimètre. Maintenant, réglez la gamme des spectres de l’ultraviolet lointain entre 190 et 260 nanomètres et la résolution interne et la bande passante à 1 nanomètre. Enregistrez le signal de dichroïsme circulaire à une vitesse de 50 nanomètres par minute à 25 degrés Celsius. Le gel SDS-PAGE coloré en bleu de Coomassie a démontré l’enrichissement de la bande protéique SERCA au fur et à mesure que la purification progressait. L’étape finale de purification SERCA par ultracentrifugation sur un gradient de concentration de tréhalose a permis d’obtenir une pureté supérieure à 90 %. Les vésicules du réticulum sarcoplasmique contenaient une grande quantité de SERCA, avec environ 73 % de la protéine totale dans les vésicules correspondant à cette P-ATPase. Un motif cinétique de Michaelis-Menten a été observé pour le SERCA purifié dans la courbe de taux d’hydrolyse de l’ATP en fonction de la concentration d’ATP, confirmant sa fonctionnalité enzymatique. Le graphique de Lineweaver-Burk a révélé une constante de Michaelis d’environ 10 micromoles pour l’ATP, ce qui correspond aux valeurs précédemment rapportées. Le marquage FITC de SERCA a indiqué un site de liaison nucléotidique intact. La bande SERCA teintée en bleu Coomassie correspondait exactement à la bande étiquetée FITC. La spectroscopie circulaire du dichroïsme a confirmé la haute qualité structurale du SERCA purifié, son spectre indiquant des éléments de structure secondaire bien définis.