Extraction et clarification tissulaire Préparation d’échantillons de cerveau-moelle épinière de souris

Nos recherches portent sur la façon dont le système nerveux central médie les fonctions cognitives et interagit avec le système immunitaire. Notre objectif est d’améliorer les méthodes d’examen du cerveau et de la moelle épinière, en abordant les questions fondamentales sur ces interactions. Ces méthodes maintiennent l’ensemble du cerveau et de la moelle épinière intacts, ce qui nous aide à cartographier la cellule plus en profondeur en utilisant le nettoyage des tissus. Cela rend également le processus plus rapide et plus précis, réduisant le temps et les erreurs par rapport aux méthodes traditionnelles de coupe et d’imagerie.

Nous avons cartographié le cerveau et les régions de la moelle épinière connectées aux poumons, ce qui a permis de . Notre recherche portera sur l’exploration de la communication neuro-immune entre le cerveau, la moelle épinière et les poumons. Et comment cette interaction influence les réponses immunitaires.

[Instructeur] Pour commencer, fixez les membres de la souris à la large planche acrylique à l’aide de pinces en acier. À l’aide de ciseaux, coupez la peau entre les deux fémurs et continuez à couper vers le haut jusqu’à atteindre le diaphragme. Ouvrez les deux côtés du thorax à travers le diaphragme, à l’aide de ciseaux et de pinces droites pour exposer le cœur. Insérez une aiguille de perfusion de 0,7 millimètre attachée à un tube de perfusion dans le ventricule gauche et faites une incision d’un à deux millimètres dans l’appendice auriculaire droit. Après la perfusion, séparez la peau du dos et de la tête de la souris à l’aide de ciseaux ophtalmiques. Sectionnez la colonne vertébrale à l’endroit où la ligne reliant les bords arrière supérieurs des deux membres croise la colonne vertébrale. Retirez les tissus musculaires et adipeux du cou et du dos de la souris pour exposer la colonne vertébrale et le crâne. Avec des ciseaux veineux, coupez le long de l’espace médian entre les côtés gauche et droit de la colonne vertébrale et de la moelle épinière à partir de l’extrémité inférieure du canal vertébral. Retirez ensuite la partie supérieure et les côtés bilatéraux de la colonne vertébrale sectionnée pour exposer la moelle épinière. Répétez les étapes jusqu’à ce que vous atteigniez la connexion cérébrale. Placez la pointe d’une lame des ciseaux veineux entre le foramen magnum et le cerveau. Faites glisser et coupez le long de la suture médio-sagittale pour ouvrir le crâne. Utilisez des pinces pour retirer le crâne et exposer le cerveau. Maintenant, à l’aide de pinces et de ciseaux veineux, retirez le tissu de la moelle épinière du cerveau de souris de l’extrémité crânienne. À l’aide d’une pince à dissection, vous pouvez retirer la membrane de la moelle épinière au microscope stéréoscopique. Ensuite, à l’aide de sutures, fixez l’échantillon de moelle épinière cérébrale à la plaque de fixation. Ajouter au moins 20 fois le volume de l’échantillon de paraformaldéhyde à 4 %. Après la fixation, jetez le paraformaldéhyde et lavez l’échantillon trois fois avec du PBS. Pour commencer, fixez la moelle épinière du cerveau de souris extrait dans du paraformaldéhyde. Pour la solution d’élimination des lipides, mélangez les solutions A et B dans un rapport massique de neuf pour un. Ajoutez 50 millilitres de solution d’élimination des lipides dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et placez-y le tissu fixé. Après l’incubation dans la solution C, changer la solution et placer la boîte de culture avec l’échantillon complètement immergé dans la solution C sur une boîte lumineuse avec une ligne de graduation. Pour préparer une solution de gel, ajoutez 147 grammes de solution C et trois grammes d’agarose dans une bouteille en verre de 200 millilitres. Mélangez bien les composants à l’aide d’un agitateur, puis passez au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve. Transférez la solution gélifiée dans un four de laboratoire réglé à 37 degrés Celsius. Versez une couche de deux millimètres de profondeur de solution de gel tempéré à 37 degrés Celsius dans le moule et laissez-la refroidir dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes jusqu’à ce qu’elle soit semi-solide. Placez l’échantillon correspondant à l’indice de réfraction dans le moule et ajoutez la solution de gel jusqu’au niveau ou légèrement en dessous du haut de l’échantillon. Remettez le moule dans le réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Couvrir d’une lamelle et réfrigérer à nouveau. Retirez la lamelle à l’aide d’une pince à épiler et retirez l’échantillon incrusté. Ajoutez 30 millilitres de solution d’imagerie dans un tube de 50 millilitres et immergez l’échantillon dans la solution. Appliquez de l’adhésif 502 pour fixer fermement l’échantillon sur le porte-échantillon, avant de fixer le support sur l’appareil d’imagerie. Exécutez le logiciel de numérisation et sélectionnez le niveau de grossissement 4X dans la section agrandissement. Cliquez sur le bouton d’étalonnage pour activer le mode d’étalonnage. Cliquez sur le bouton d’aperçu pour passer en mode d’aperçu. Cliquez ensuite sur le bouton de mouvement dans la direction Z pour déplacer lentement l’échantillon vers le haut à partir du bas de la chambre d’échantillonnage jusqu’à ce que la feuille de lumière générée traverse l’échantillon. Sélectionnez le canal laser et l’option de mode d’éclairage appropriés. Sélectionnez la direction du chemin de balayage de l’échantillon. Cliquez sur le bouton de balayage automatique pour commencer à capturer les images de l’échantillon. Le protocole a réussi à préserver l’intégralité du cerveau et de la moelle épinière de la souris tout en maintenant des signaux fluorescents intacts pour une imagerie claire. L’imagerie fluorescente de l’échantillon de moelle épinière du cerveau a clairement visualisé les structures neuronales détaillées. Des images à plus fort grossissement ont permis une meilleure visualisation des cellules individuelles marquées par fluorescence.