Stratégie d’interférence CRISPR double pour cibler les interactions létales synthétiques entre des ARN non codants dans des cellules cancéreuses

Notre objectif est d’identifier systématiquement et de cibler thérapeutiquement les centres de réseau critiques, en mettant l’accent sur les ARN non codants dans le cancer. Le défi expérimental actuel de notre approche réside dans la capacité combinatoire nécessaire pour générer et cribler un grand nombre de gènes en parallèle. Notre objectif est d’ouvrir la voie à l’identification de nouvelles cibles combinatoires d’ARN non codants ou de structures médicamenteuses pour contourner la résistance et l’échappement thérapeutique.

À l’avenir, nous traduirons cet outil de preuve de concept en efforts de criblage de banques combinatoires à grande échelle, potentiellement en combinaison avec des protéines de liaison à l’ARN, à la fois in vitro et in vivo. Pour commencer, comptage des cellules Lenti-X 293T HEK à l’aide du colorant bleu Trypan dans un hémocytomètre. Plaquez 4 fois 10 à la puissance 6 cellules Lenti-X 293T HEK par plaque de 10 centimètres et incubez pour atteindre environ 80 % de confluence le lendemain.

À partir de cette étape, travaillez dans un laboratoire de classe 2. Mélangez 500 microlitres d’un milieu de transfection approprié avec un vecteur de transfert, un plasmide d’enveloppe et un vecteur pPAX2. Incuber le mélange pendant cinq minutes à température ambiante.

Dans un tube séparé, mélangez 500 microlitres de milieu sérique réduit avec 36 microlitres de réactif PEI à une concentration de 1 milligramme par millilitre. Incuber le mélange pendant cinq minutes à température ambiante. Mélangez les deux mélanges et laissez incuber pendant 15 minutes à température ambiante.

Maintenant, avec précaution, ajoutez le mélange au milieu cellulaire contenant six millilitres et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Après 12 à 15 heures, jeter le milieu dans une bouteille de déchets autoclavable à l’aide d’une pipette sérologique. Rincez les consommables, y compris les pipettes sérologiques et les pointes de pipette, avec une solution désinfectante avant de les jeter dans les déchets de l’autoclave.

Ajoutez cinq millilitres de DMEM frais dans les cellules transfectées à l’aide d’une pipette neuve. Pour récolter les lentivirus, transférez le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique dans un tube canonique de 50 millilitres, 48 heures après la transfection. Ajoutez ensuite 5 millilitres de milieu frais aux cellules et incubez-les pendant 24 heures supplémentaires.

Conservez le tube au réfrigérateur. Après l’incubation, répétez la collecte de lentivirus et regroupez-la avec l’échantillon recueilli précédemment. Après la troisième récolte, stocker les surnageants combinés des trois récoltes à quatre degrés Celsius jusqu’à la filtration et la centrifugation.

Centrifugez le surnageant combiné pendant 5 minutes à 500 G et 4 degrés Celsius dans des récipients étanches aux aérosols et des rotors approuvés pour les organismes du groupe de risque 2, puis filtrez le surnageant à l’aide de filtres à seringue stériles de 0,2 micromètre de qualité culture cellulaire. Concentrer le surnageant filtré à 1000 G et quatre degrés Celsius à l’aide d’une unité de filtration centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons à environ 500 microlitres. Conservez les aliquotes virales de 50 à 100 microlitres à moins 80 degrés Celsius jusqu’à nouvel ordre.

Plaquez des cellules 501-mel dans une plaque à six puits à 2 fois 10 à la puissance 5 cellules par puits avec un volume de culture final de 2 millilitres un jour avant la transduction. Remplacer le milieu de culture par 2 millilitres de DMEM préchauffé complété par du polybrène à une concentration finale de 6 microgrammes par millilitre. Travailler dans un laboratoire de classe 2 à partir de cette étape.

Ajoutez 50 microlitres de lentivirus SPD et SAD préparés simultanément aux cellules dans le sens de la goutte. Secouez doucement la plaque et incubez-la à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %. 16 heures après la transduction, jeter le milieu dans un flacon autoclavable à l’aide d’une pipette sérologique.

Ajouter 2 millilitres de milieu frais contenant 10 microgrammes par millilitre de blasticidine et 2 microgrammes par millilitre de puromycine. Répétez l’étape de remplacement du milieu après deux jours et manipulez les cellules transduites dans des conditions S1 après sept jours après la transduction. Grainez 0,1 fois 10 à la puissance 5 cellules contenant des SadCas9 KRAB et Sp-dCas9-KRAB transfectés stables sept jours après la transduction dans une plaque de 96 puits avec 100 microlitres de DMEM préchauffé.

Le jour de la transduction, remplacez le milieu par 100 microlitres de DMEM préchauffé complété par du polybrène à 6 microgrammes par millilitre. Ajoutez le volume approprié de lentivirus aux cellules et incubez la plaque. Après 16 heures, remplacez le milieu par un milieu frais contenant de la zéoïne, de la blasticidine et de la puromycine.

Effectuer la détection de la luminescence cinq jours après la transduction à l’aide d’un test de viabilité cellulaire conformément aux instructions du fabricant. L’analyse sanguine occidentale a confirmé l’expression réussie des protéines de fusion SpdCas9 et SadCas9 dans les cellules du transducteur 501-mel. L’analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase a montré une neutralisation efficace des ARN longs non codants individuels RP11 et XLOC à l’aide d’ARN guides spécifiques, mais seule la paire XLOC-sa et RP11-sp a réussi à réprimer les deux cibles simultanément.

La double répression de RP11 et XLOC à l’aide de la paire GRNA XLOC-sa et RP11-sp a significativement réduit la viabilité des cellules 501-mel à 59 % par rapport au contrôle.